HPLC法测定匹多莫德口服液中L-噻唑烷-4-羧酸的含量

郝桂明，王玉霞，王 卫

（天津市药品检验研究院，天津 300070）

匹多莫德(pidotimod)是一种免疫调节剂，其结构类似于二肽［1］，因为具有疗效显著、耐受性好、安全性高等优点被广泛应用于免疫功能低下的人群。匹多莫德口服液于1993年由普利化学工业公司在意大利上市，临床上主要用于反复发作感染和急慢性感染的辅助治疗［2-3］。目前，匹多莫德口服液在国内外药典中均未见收载，现行的国家药品标准中也未对其特异性杂质进行控制。笔者采用RP-HPLC-外标法对匹多莫德口服液中的L-噻唑烷-4-羧酸含量进行测定，可有效地控制其质量，方法准确度高、灵敏性好、结果可靠。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪（型号：安捷伦1260，包括PDA检测器、Open-lab CDS色谱工作站）；METTLER XS205电子天平（梅特勒公司）。

1.2 试药 匹多莫德口服液（江苏吴中医药集团有限公司；批号2015020201、2017081408、2017092518）；L-噻唑烷-4-羧酸对照品（EUTICAL S.p.A公司提供，批号08/0701，纯度：99.5%）。甲醇、异丙醇均为色谱纯（天津市康科德），磷酸二氢钠为分析纯（阿拉丁化学试剂），水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱采用Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液（用85%磷酸调节pH值至2.5），流动相B为甲醇-异丙醇（2∶1），按表1程序进行梯度洗脱；流速为1.0 ml/min；检测波长为210 nm；柱温为25℃；进样量为10 μl。

表1 梯度洗脱程序表

2.2溶液的制备

2.2.1 供试品溶液 精密量取本品适量（约相当于匹多莫德25 mg），置50 ml量瓶中，加溶剂［0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液（用85%磷酸调节pH值至2.5）-甲醇-异丙醇（97∶2∶1）］适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 对照品溶液 精密量取L-噻唑烷-4-羧酸对照品10 mg，置20 ml量瓶中，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液，量取1.0 ml，置100 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 系统适用性试验 取本品适量（约相当于匹多莫德50 mg），置100 ml量瓶中，加入3%过氧化氢溶液3 ml，振摇，室温放置15 min，加入对照品贮备液1.0 ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。分别精密量取系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1。

图1 系统适用性溶液（A）对照品（B）供试品（C）HPLC色谱图

2.4 专属性试验

2.4.1 空白辅料溶液 取混合好的空白辅料5 ml，置200 ml量瓶中，用适量溶剂振摇使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得，结果表明（见色谱图2A），空白辅料无干扰。

2.4.2 酸破坏样品溶液 精密量取本品5 ml（批号2015020201），置200 ml量瓶中，加4 mol/L盐酸溶液20 ml，超声振荡15 min，在室温放置4 h后，用4 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至中性，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4.3 碱破坏样品溶液 精密量取本品5 ml（批号2015020201），置200 ml量瓶中，加1 mol/L氢氧化钠溶液10 ml，超声振荡15 min，在室温放置3 h，用1 mol/L盐酸溶液调节pH值至中性，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4.4 氧化破坏样品溶液 精密量取本品5 ml（批号2015020201），置200 ml量瓶中，加5 ml溶剂使溶解，加30%过氧化氢溶液1 ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀，在室温放置2 h后，滤过，即得。

2.4.5 高温破坏样品溶液 精密量取本品5 ml（批号2015020201），置200 ml量瓶中，加溶剂适量振摇使溶解，80℃水浴加热4 h，放冷至室温，用溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.4.6 光照破坏样品溶液 精密量取本品5 ml（批号2015020201），置200 ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。样品溶液在日光下放置14 d，滤过，即得。

分别精密量取上述空白辅料溶液及各破坏条件下的样品溶液各10 μl，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图（见图2）。结果表明，经上述条件下产生的降解产物与L-噻唑烷-4-羧酸峰均能达到完全分离。

图2 空白辅料（A）酸破坏（B）碱破坏（C）氧化破坏（D）高温破坏（E）光照破坏（F）HPLC色谱图

2.5 线性关系考查 精密量取“2.2.2”项下对照品贮备液适量，采用逐步稀释法，用溶剂稀释使成梯度浓度。按“2.1”项下色谱条件分别进样测定，记录L-噻唑烷-4-羧酸峰面积。以浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归。线性方程为Y=2.020X＋0.135（r=0.999 5，n=9），线性范围为0.54～16.10 μg/ml。

2.6 检测限与定量限考查 取“2.2.2”项下对照品溶液适量，用溶剂逐步稀释浓度，记录色谱图。以S/N为3∶1计算检测限，以S/N为10∶1计算定量限。检测限和定量限分别为2.7和10.7 ng。

2.7 精密度试验 取“2.2.2”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录L-噻唑烷-4-羧酸峰面积，RSD为1.3%，表明本方法精密度良好。

2.8 重复性试验 按“2.2.1”项下的方法平行制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进行测定，L-噻唑烷-4-羧酸峰面积的RSD为1.7%，表明本方法重复性良好。

2.9 稳定性试验 取“2.2.1”项下制备的供试品溶液，在室温条件下分别放置0、6、12和24 h后进行测定，记录色谱图。结果表明，随着放置时间延长，L-噻唑烷-4-羧酸有增长的趋势，故供试品溶液须临用新制。

2.10 加样回收率试验 精密称取已知L-噻唑烷-4-羧酸含量的匹多莫德口服液（批号2015020201）5 ml，共6份，分别置200 ml量瓶中，加溶剂适量使溶解，分别精密加入“2.2.2”项下对照品贮备液2 ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录L-噻唑烷-4-羧酸的峰面积并计算加样回收率，结果平均回收率为101.73%，RSD为0.52%，见表2。

表2 加样回收率测定结果（n=6）

2.11 样品的有关物质测定 取匹多莫德口服液3批（批号2015020201、2017081408、2017092518），按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算L-噻唑烷-4-羧酸含量。3批样品测定结果分别为1.11%、0.65%和0.56%。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择 笔者在前期试验中发现［4］，采用现行国家药品标准的等度洗脱方法进行匹多莫德口服溶液有关物质检查时，在相对保留时间为0.24处出现一个色谱峰，虽然该色谱峰与L-噻唑烷-4-羧酸对照品的保留时间一致，但并非同一物质。若将该色谱峰归属为L-噻唑烷-4-羧酸，因其校正因子较大（f=10.18），会导致测定结果造成误判。当将流动相改为纯水相（0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液，用85%磷酸调节pH值至2.5）时，该色谱峰分离为3个色谱峰，分别为L-噻唑烷-4-羧酸和两个氧化降解杂质，但在纯水相的色谱条件下，主成分在色谱柱中保留时间过长（tR＞60 min），而且对色谱柱的要求较高。采用本方法的梯度洗脱色谱条件，L-噻唑烷-4-羧酸峰和氧化降解杂质峰能达到完全分离，同时主成分能够在15 min左右快速洗脱，可以满足匹多莫德口服液中L-噻唑烷-4-羧酸含量测定的要求。

3.2 限度的确定 现行国家药品标准有关物质项下只规定了杂质总量不得过2.0%，未规定特异性杂质和其他单个杂质的限度。匹多莫德口服液与匹多莫德原料及其他制剂相比较，L-噻唑烷-4-羧酸及两个氧化降解杂质的含量明显增加。L-噻唑烷-4-羧酸急性毒性较低，人体经口服的最低中毒剂量为420 mg/kg，主要毒副作用为嗜睡、震颤和肾功能低下。并且匹多莫德口服液自上市以来，产品质量较稳定，不良反应较少。基于上述原因，将限度规定为L-噻唑烷-4-羧酸不得过1.0%。

综上所述，采用笔者建立的RP-HPLC法测定匹多莫德口服液中L-噻唑烷-4-羧酸的含量，方法灵敏度、准确、可靠，可有效控制匹多莫德口服液的质量。