当归-川芎药对治疗原发性痛经的网络药理学研究

张 科，谷冬梅，李 波，宋 崟，李正翔，袁恒杰

（天津医科大学总医院药剂科1，检验科2，天津 300052）

原发性痛经（primary dysmenorrhea，PD）是一种青春期女性在月经前后或经期常见疾病，轻者为下腹疼痛、坠胀，重者会出现恶心呕吐、冷汗淋漓甚至昏厥等症状，影响患者的正常生活。PD 的发病机制目前尚未完全阐明，临床很难根治[1]。PD 治疗以药物治疗为主，常用药物为非甾体抗炎药，但治疗效果不佳，且不良反应明显[2]。中医治疗PD 具有独特的优势，痛经在中医辨证上属于“经行腹痛”的范畴，是由于气滞血瘀、经血不畅引起的或者是由于着凉受寒所引起的[3]，治则以活血化瘀、行气止痛为法[4]。当归-川芎是于补血活血、化瘀止痛的经典药对。当归性温味甘辛，归心、肝、脾经，善补血活血，调经止痛，润肠通便，并能散寒，凡血虚血瘀有寒症均宜，为妇科调经之要药。川芎性温味辛，归肝、胆、心包经，善活血行气，祛风止痛，治血瘀气滞诸痛，兼寒者最宜[5]。近年来，基于网络药理学探究中药多成分、多靶点作用机制成为研究热点，本文拟采用该方法探究当归-川芎药对治疗PD 的作用机制，以期为其临床应用提供参考。

1 资料与方法

1.1 活性成分及靶点的筛选 基于TCMSP 数据库，以“当归”“川芎”为关键词检索，收集药材的化学成分，然后以OB≥30%和DL≥0.18 为条件筛选有效成分[6，7]。收集数据库中成分对应的靶点，并使用Uniprot 数据库，将靶点转换标准基因名。

1.2 当归-川芎药对治疗PD 的靶点的筛选 基于Genecards 数据库，以“Primary Dysmenorrhea”为关键词检索，收集UC 疾病靶点，以Excel 格式导出，然后将1.1 中成分靶点的标准基因与疾病靶点基因取交集，作为当归-川芎药对治疗PD 的靶点。

1.3 活性成分-靶点网络的构建 将1.1 中成分和靶点信息处理后导入Cytoscape 软件中绘制活性成分-靶点网络图，然后对网络进行拓扑结构分析，其中不同类型节点分别代表有效成分和靶点，边代表两者之间的关系。再根据节点连接度（Degree）和介数中心性（BC）对网络图进行调整，节点的大小反映Degree 的大小。

1.4 蛋白质相互作用网络（PPI）的构建及其核心靶点的筛选 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络是从生物化学、信号转导和遗传网络的角度研究成分和疾病相关蛋白之间的相关性[8]。使用在线韦恩图工具，获取药对成分靶点和疾病靶点的交集基因，将交集基因导入STRING 数据库进行分析，将分析数据以TSV 格式导出，导入Cytoscape 软件，绘制当归-川芎药对与PD 靶点的PPI 网络，并对网络进行拓扑结构分析，再使用“Generate style from statistics”工具对网络节点的大小和颜色进行设置。网络图中节点的大小、颜色深浅代表Degree 值的大小，边的粗细反映了Combine Score 的大小，从中筛选出Degree 值和接近中心度排名靠前的靶点作为核心靶点。

1.5 核心靶点的通路分析 DAVID 数据库能提供系统的生物功能注释信息，进行基因本体论（gene ontology，GO）富集分析和KEGG 通路分析，由此挖掘特定基因或蛋白的生物学意义[9]。将当归-川芎药对治疗PD 靶点导入DAVID 数据库，并限定物种为人，进行基因功能注释分析和功能富集分析，然后导出数据，对生物过程（P＜0.01）和信号通路（P＜0.05）进行筛选，并进行绘图。

2 结果

2.1 当归-川芎药对活性成分的确定 在TCMSP 数据库中检索到“当归”“川芎”得到化学成分314 个，其中125 个来自当归，189 个来自川芎。以OB≥30%和DL≥0.18 筛选出活性成分9 个，其中2 个来自当归，7 个来自川芎，包括β-谷甾醇、豆甾醇、谷甾醇、叶酸、亚油酸乙酯、杨梅酮、川芎哚、川芎萘呋内酯、洋川芎醌碱，具体信息见表1。检索得到9 个成分对应靶点111 个：β-谷甾醇对应靶点38 个，豆甾醇对应靶点31 个，谷甾醇对应靶点3 个，叶酸对应靶点3 个，亚油酸乙酯对应靶点3 个，杨梅酮对应靶点25 个，川芎哚对应靶点4 个，川芎萘呋内酯对应靶点4 个，洋川芎醌没有对应靶点。将所得靶点蛋白名称转换为标准基因名，删除重复和无效靶点，共获取当归-川芎药对成分作用靶点69 个。

表1 当归-川芎中9 个活性成分的基本信息

2.2 活性成分-靶点网络 活性成分-靶点网络共包括77 个节点（8 个活性成分节点，其中1 个成分没有对应靶点，69 个靶点节点）和111 条边，见图1。分析网络可知，1 个活性成分平均作用13.88 个靶点，1 个靶点平均作用1.61 个活性成分。从活性成分的角度，8 个活性成分中作用靶点数量最多的前3个成分为DG-1（β-谷甾醇）、DG-2（豆甾醇）、CX-4（杨梅黄酮），分别能与38、31、25 个靶点发生相互作用。从靶点的角度，度值排名前5 位的是PTGS2、NCOA2、PTGS1、PRKACA、SCN5A，分别能与6、5、4、3、3 个活性成分发生相互作用。

图1 当归-川芎活性成分-靶点网络图

2.3 成分靶点与疾病靶点的交集 通过数据库获得当归活性成分作用靶点69 个，川芎活性成分作用靶点42 个，PD352 个相关基因。通过在线韦恩图得出当归、川芎与PD 共有基因4 个，分别是PTGS1、PTGS2、PGR、ADRB2；当归与PD 的共有基因8 个，分别是BAX、BCL2、CASP3、CHRM2、CHRM3、OPRM1、TGFB1、PLAU；川芎与PD 的共有基因4 个，分别是ESR1、ESR2、PPARG、KDR。当归-川芎药对活性活性成分作用靶点与PD 共有16 个交集基因，见图2。

图2 交集基因的韦恩图

2.4 PPI 网络分析 将交集基因导入STRING 数据库进行分析显示，PPI 网络包含15 个节点（其中CHRM3 靶点与其他靶点没有连接关系），34 条边，平均节点Degree 值为4.25。网络中Degree 值排名前5 的靶点分别是CASP3、PTGS2、ESR1、TGFB1、KDR、PPARG。从STRING 数据库中将分析数据以TSV 格式导出，然后导入Cytoscape 软件中，绘制当归-川芎药对与UC 靶点的PPI 网络图，见图3。

图3 当归-川芎作用靶点与PD 蛋白互作网络图

2.5 功能注释分析和富集分析 当归-川芎药对与PD 的交集基因共在108 个（P＜0.05）GO term 上富集，其中生物过程（BP）78 个，分子功能（CC）11 个，细胞组成（MF）19 个，见图4。主要涉及生物学功能与过程包括雌二醇调节、类固醇激素介导的信号通路、NO 生物合成过程的正向调节、糖皮质激素反应等；交集基因共在62 条（P＜0.05）通路上富集，主要通过调控雌激素信号通路、NF-κB 信号通路、细胞凋亡等发挥作用，见图5。

图4 GO 富集分析图

图5 KEGG 富集分析的16 条通路图

3 讨论

原发性痛经的发病机制可能与前列腺素水平升高、白细胞介数水平升高、血管内皮细胞功能障碍和经期体内激素水平的变化密切相关[1]。前列腺素水平升高可使子宫平滑肌的血流量减少，出现收缩甚至痉挛，增加周围神经对疼痛的敏感性。研究表明[10]，与生殖系统密切相关的前列腺素是PGE2和PGF2α，在月经周期的不同阶段子宫内膜中二者的含量呈周期性变化。黄体期及月经期子宫内膜产生的前列腺类产物增多，黄体期PGE2的含量比PGF2α 高，而月经期则相反。此外，原发性痛经与经期性激素变化也有关，雌二醇（E2）可使子宫肌细胞的钙离子内流，引起子宫收缩，同时还可以通过激活磷酸肌醇循环，促进PGF2α 的合成，降低疼痛阈值。本研究药对中当归为气中之血药，擅补血活血、调经止痛；川芎为血中之气药，可活血行气、祛瘀止痛，二药配伍，既可补血活血以调经，又能行气祛瘀以止痛[5]。

本研究活性成分-靶点网络中当归-川芎药对中8 个活性成分通过作用于69 个靶点发挥药理作用，同时网络中度值排名前2 个活性成分分别是β-谷甾醇和豆甾醇，二者均证实有明显的抗炎作用。β-谷甾醇通过提高抗炎因子IL-10 的活性，减小趋化因子和促炎因子活性等抑制核转录因子（NF-κB）的迁移[11]。豆甾醇可明显减少由脂多糖刺激增多的致炎因子环氧化酶-2 和诱生型一氧化氮合酶mRNA 的表达，进而减少PGE2 和NO 的释放发挥抗炎作用[12]。从活性成分-疾病交集靶点可知，当归-川芎药对治疗原发性痛经是多靶点协同作用的，如调节炎症细胞因子TGFB1 和PTGS2，作用于阿片样物质受体OPRM1 等；GO 富集分析显示，疾病靶点主要富集在BP 环节，如雌二醇调节、类固醇激素介导的信号通路、NO 生物合成过程的正向调节、糖皮质激素反应等；从DAVID 通路分析显示，疾病靶点涉及的通路与PD 相关包括雌激素信号通路、NF-κB 信号通路、细胞凋亡等，其中雌激素信号通路涉及的靶点有IL6、TNF、SLC2A4、PTPN1、INSR，NF-κB 信号通路涉及的靶点有TNF、SLC2A4、INSR，细胞凋亡涉及的靶点有SLC2A4、PTPN1、INSR。

综上所述，当归-川芎药对中多个成分作用于多个靶点和通路，可发挥治疗PD 的作用。