利用体外产气法评价玉米秸秆黄贮与甜菜块根组合效应

2021-07-28冉生斌刘建华

草业科学 2021年6期

冉生斌，刘建华

（甘肃省农业科学院经济作物与啤酒原料研究所，甘肃兰州 730070）

甜菜(Beta vulgaris)是一种重要的能源作物[1]，甜菜块根具有丰富的营养价值，碳水化合物含量高，粗纤维含量低，矿物质及微量元素丰富，饲用价值较高，国外甜菜已成为反刍动物饲草料的主要来源之一[2-3]。国家统计局数据表明，2018 年我国农作物秸秆产量高达8 亿 t，北方农作物秸秆产量约4 亿 t，占全国产量的50%左右，但由于农作物秸秆自身纤维含量高，营养价值低，以及饲用化利用技术的限制，约40%的农作物秸秆被焚烧或丢弃，导致资源严重浪费。在我国北方地区，甜菜是一种普遍的经济作物，生产季节与枯草期同季，一方面可弥补冬季饲草短缺的问题，另一方面可以和其他农作物秸秆组合利用，提高农作物秸秆的饲用率。甜菜非结构性碳水化合物含量(non-structural carbohydrate,NSC)较高，在瘤胃内环境中发酵速率较快，营养物质被微生物迅速降解。奶牛饲喂试验结果表明，青贮后的甜菜渣可以提高奶牛混合日粮的能量水平，促进瘤胃微生物蛋白的合成[4]。然而，反刍动物在采食少量非结构性碳水化合物后，对唾液的产生及反刍功能的刺激较弱，不能充分消化吸收，非结构性碳水化合物采食过量时，会在微生物作用下过度发酵，改变瘤胃内环境稳态，影响日粮中营养物质的消化吸收，甚至导致代谢类疾病的发生，这种改变对纤维素分解菌的影响最大[5]。但在高水平结构性碳水化合物(structural carbohydrate，SC)日粮中，适量的非结构性碳水化合物又能增加微生物的活性。研究发现，饲粮中不同来源的碳水化合物(NSC、SC)比例对家畜干物质采食量有显著影响[6]。王梦芝等[7]研究表明，不同的NSC/SC 饲粮在瘤胃中发酵时，发酵特性也各有差异，饲粮中纤维素水平的变化对瘤胃液pH 有显著影响，瘤胃液pH 随纤维素水平增加而逐渐升高。结构与非结构性碳水化合物来源的粗饲料最佳组合直接影响动物的生产性能，因此，拟选取不同比例的玉米(Zea mays)秸秆黄贮和甜菜块根为粗饲料来源，研究体外发酵组合效应，提高甜菜块根在反刍动物生产中的利用，为反刍动物健康高效养殖提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用玉米秸秆黄贮和甜菜块根均由甘肃省农业科学院试验农场提供。将风干后的饲草原料粉碎过0.45 mm 筛后测定营养成分[8]。饲草原料营养成分如表1 所列。试验选取3 只健康且体况相近装有永久瘤胃瘘管的小尾寒羊公羊，作为瘤胃液供体，供体羊饲粮精粗比为40 ∶ 60，其组成及营养水平如表2 所列。

表1 饲草原料的营养成分Table 1 Nutritional composition of forage material%

表2 饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 2 Composition and nutrient of diet for fistulate sheep (DM basis)

1.2 试验设计

试验采用单因素完全随机设计，将玉米秸秆黄贮和甜菜块根65 ℃烘干后，通过高速粉碎机(XFB-200)粉碎，过0.45 mm 筛，以100 ∶ 0 (T1)、80 ∶ 20 (T2)、60 ∶ 40 (T3)、50 ∶ 50 (T4)、40 ∶ 60 (T5)、20 ∶ 80、0 ∶ 100(T6)的比例进行组合，每个组合4 个重复。同一批次中设定空白，作为产气量校正。不同比例混合后的营养成分如表3 所列。

表3 不同比例混合后的营养成分Table 3 Nutritional composition of the mixture in different proportions%

1.3 体外发酵及样品采集

瘤胃液采集及测定均参照周瑞等[9]方法进行，体外产气装置采用ANKOM RFS (美国ANKOM Technology Corporation)全自动记录装置气体测量系统，瘤胃缓冲液按Menke 等[10]方法配制。产气测定时分别统计发酵时间点(2、4、8、12、12、24 和48 h)的产气压力。48 h 后在冰水浴中终止发酵，收集发酵液测定发酵参数，收集发酵残渣测定养分含量。

1.4 测定指标及测定方法

1.4.1 养分测定

干物质(dry matter，DM)、粗蛋白(crude protein，CP)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)和中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)参照《饲料分析及饲养质量检测技术》[8]测定，水溶性碳水化合物(WSC)含量测定采用蒽酮比色法[11]。干物质降解率(dry matter degradability，DMD)、中性洗涤纤维降解率(neutral detergent fiber degradability，NDFD)、酸性洗涤纤维降解率(acid detergent fiber degradability，ADFD)由下列公式计算得出。

DMD = (饲粮干物质含量 - 残渣中干物质含量)/饲粮干物质含量；

ADFD = (饲粮酸性洗涤纤维含量 - 残渣酸性洗涤纤维含量)/饲粮酸性洗涤纤维含量；

ADFD = (饲粮中性洗涤纤维含量 - 残渣中性洗涤纤维含量)/饲粮中性洗涤纤维含量。

1.4.2 发酵参数及总产气量测定

发酵液pH 用pH 计(HAN-NA)测定；NH3-N 浓度使用苯酚–次氯酸钠比色法测定[12]；微生物蛋白(microbial protein，MCP)采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定；挥发性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)采用气相色谱仪(日本岛津GC-2010 Plus)测定[13]，色谱柱为AT-FFAP 毛细管色谱柱，进样量为1 μL，分流比为30 ∶ 1，采用程序升温共16 min，初始温度为100 ℃，保留2 min，升温速率6 ℃·min-1，到130 ℃保持1 min，再以10 ℃·min-1的升温速率，到190 ℃保持2 min，检测器温度230 ℃。产气量(Total gas production)由ANKOM RFS 气体测量系统记录的气体压力来计算。

式中：Vx为产气总体积(mL)；Vj为发酵瓶顶部空间体积(mL)；Ppsi为气体测量系统自动记录的压力(kPa)。

1.4.3 饲草组合效应的估算

单项组合效应指数(single-factor associative effects index, SFAEI)和多项组合效应综合指数 (multiple-factors associative effects index, MFAEI)计算公式如下：

式中：实测值为实际测定值(发酵参数、挥发性脂肪酸、养分降解率、总产气量)；加权估算值 = 玉米秸秆黄贮实测值 × 玉米秸秆黄贮百分比(%) + 甜菜块根实测值 × 甜菜块根百分比(%)。

1.5 数据统计与分析

采用SPSS 19.0 软件进行单因素方差分析(oneway ANOVA)，用LSD 进行多重比较。以P＜ 0.05 作为差异显著的判断标准。

2 结果

2.1 玉米秸秆黄贮与甜菜块根组合对体外养分降解率的影响

玉米秸秆黄贮与甜菜块根组合对体外养分降解率的影响结果(表4)显示，随着甜菜块根比例的增加，体外养分降解率呈现先升高后降低的趋势。T3、T4组DMD 显著高于T1、T2、T6、T7(P＜ 0.001)；T3组NDFD 显著高于其他组(P= 0.004)；T3、T4、T5组ADFD 显著高于其他组(P= 0.016)。

表4 玉米秸秆黄贮与甜菜块根组合对体外养分降解率的影响Table 4 Effect of ratios of corn straw silage to beet root on nutrition degradability in vitro%

2.2 玉米秸秆黄贮与甜菜块根组合对体外总产气量的影响

玉米秸秆黄贮与甜菜块根组合对体外总产气量的影响结果(表5)显示，随着发酵时间的延长，总产气量逐渐升高，而随着甜菜块根比例的增加，在发酵2～12 h，总产气量呈现先升高后降低的趋势，在发酵24～48 h，总产气量(GP)呈现先升高后降低再升高再降低的波动趋势。时间对总产气量有显著效应(P＜ 0.001)，且时间和处理互作效应显著(P= 0.006)。发酵2 h，T3组总产气量最高(31.60 mL·g-1)，T1组总产气量最低(23.89 mL·g-1)，T3、T4组总产气量显著高于T1、T2、T7组(P= 0.031)，发酵4、8、12 h，T3组总产气量均最高(52.13、79.49、101.31 mL·g-1)，T7组总产气量均最低(39.73、57.52、82.40 mL·g-1)，T3组总产气量显著高于T1、T6、T7组(P＜ 0.004)，发酵24、48 h，T4组总产气量均最高(132.5、146.53 mL·g-1)，T7组总产气量均最低(113.74、119.85 mL·g-1)，T4组总产气量均显著高于T6、T7组(P＜ 0.008)。

表5 玉米秸秆黄贮与甜菜块根组合对体外总产气量的影响Table 5 Effect of ratios of corn straw silage to beet root on total gas production in vitro mL·g-1

2.3 玉米秸秆黄贮与甜菜块根组合对体外发酵参数的影响

玉米秸秆黄贮与甜菜块根组合对体外发酵参数的影响结果(表6)显示，随着甜菜块根比例的增加，pH 逐渐降低， T1组pH 显著高于其他组(P＜0.001)；T3、T6组NH3-N 浓度显著低于其他组(P=0.003)；T3组MCP 浓度显著高于T1、T2、T6、T7(P＜0.001)。挥发性脂肪酸总体呈现先升高后降低趋势，T3组总挥发性脂肪酸(TVFAs)、乙酸浓度显著高于其他组(P＜ 0.05)；T3组丙酸、丁酸浓度以及乙酸/丙酸值显著高于T1、T2、T6、T7组(P＜ 0.05)；T3组异丁酸、戊酸、异戊酸浓度均显著高于T6、T7组(P＜ 0.02)。

表6 玉米秸秆黄贮与甜菜块根组合对体外瘤胃发酵参数的影响Table 6 Effect of ratios of corn straw silage to beet root on fermentation parameter in vitro

2.4 玉米秸秆黄贮与甜菜块根体外发酵组合效应

玉米秸秆黄贮与甜菜块根组合效应结果(表7)显示，从单项组合效应来看，不同比例组合后，NH3-N浓度为负组合效应，T3组MCP、TVFAs、乙酸/丙酸以及各挥发酸均为最大正组合效应，T2、T4组丙酸为负组合效应，T3组DMD、NDFD、ADFD 均为最大正组合效应，T4组总产气量为最大正组合效应；从多项组合效应综合指数来看，不同比例组合后，均为正组合效应，且T3组综合指数最大，T6组综合指数最小。

表7 玉米秸秆黄贮与甜菜块根体外发酵组合效应Table 7 Associative effects of ratios of corn straw silage to beet root on fermentation in vitro

3 讨论

3.1 玉米秸秆黄贮与甜菜块根组合对体外养分降解率的影响

体外养分降解率反映其被动物消化利用的难易程度，同时也反映饲料在发酵体系中被微生物的降解效果[14]。本研究发现，体外瘤胃养分降解率随玉米秸秆黄贮与甜菜块根比例的变化而改变。Zhang 等[15]研究表明，玉米秸秆和饲用甜高粱(Sorghum dochna)在不同比例青贮时其体外干物质降解率和有机物降解率存在显著差异，Ponce 等[16]研究表明日粮中玉米秸秆青贮比例的高低显著影响体外发酵营养物质消化率。随着甜菜块根比例的增加，体外瘤胃养分降解率呈现先升高后降低的趋势。吴征敏等[17]在皇竹草(Pennisetum sinese)与喷浆玉米皮组合效应的研究中发现，随着组合中喷浆玉米皮比例的增加，山羊体外瘤胃干物质降解率显著升高。本研究表明，组合后的体外瘤胃养分降解率均高于单一粗饲料组，这可能是因为粗饲料自身养分含量不同，导致瘤胃内降解特性不同造成的[18-19]，另外秸秆中不同结构的碳水化合物类型也会影响其干物质降解率[20]。因此，随着甜菜块根比例的增加，瘤胃体外DM、NDF、ADF 降解率先升高后降低，这可能是由于甜菜块根中的可消化有机物及非结构性碳水化合物含量随甜菜块根的比例逐渐升高造成的[21]。甜菜块根比例的增加，使得组合后粗饲料的NDF、ADF 含量降低，CP 含量升高，这不仅更有利于微生物对粗饲料养分的降解，而且为瘤胃微生物提供充足的能量来源和氮源[9]。因此，在甜菜添加的一定范围内，随着甜菜添加比例的增大，组合饲料中能氮比例更加协调，瘤胃微生物对饲料能氮的循环利用更高，同时微生物活性增强，养分降解率逐渐升高。但是粗饲料中养分降解率的变化并不是随着甜菜块根比例的增加呈线性增加趋势，当甜菜块根比例大于50%时，养分降解率又逐渐降低，这可能是由于甜菜块根过多，导致非结构性碳水化合物含量过高，其在瘤胃中迅速发酵而改变瘤胃发酵模式，破坏瘤胃内环境，养分降解率相应降低。

3.2 玉米秸秆黄贮与甜菜块根组合对体外总产气量的影响

总产气量是饲料在瘤胃中发酵程度的直观表现[22]。饲料在瘤胃中发酵程度越大则产气量越大[23]。本研究中，不同比例组合后GP 随发酵时间的增加而增加，这是由于发酵期，GP 不断累积造成的，同时也说明体外发酵48 h，微生物对底物仍然有降解作用。当甜菜块根比例为40%时，GP 最高，此时瘤胃发酵程度最大。当甜菜块根比例大于40%时，由于组合饲料非结构性碳水化合物过高，发酵受到抑制，产气量逐渐降低。这与本研究中挥发酸浓度先升高后降低一致。

3.3 玉米秸秆黄贮与甜菜块根组合对体外发酵参数的影响

pH 是瘤胃内环境稳态的反映指标，主要受饲料、唾液和发酵产物的影响[24]。本研究发现，随甜菜块根比例的增加，瘤胃pH 逐渐降低。瘤胃pH 的适宜范围在6.2～7.0，当pH 过低时，会抑制瘤胃内纤维降解菌的活性[25]。当甜菜块根添加量小于50%时，pH 6.6～6.2，说明瘤胃内均可正常发酵；当甜菜块根添加量大于50%时，pH 5.7～6.0，因此，甜菜块根添加过量会导致pH 降低，抑制饲粮中纤维的降解，养分降解率下降[26]。

NH3-N 浓度反映了瘤胃微生物对氨的利用程度[27]。适宜的NH3-N 浓度有利于增强瘤胃微生物活性，而过高会造成养分浪费，过低会降低瘤胃微生物活性[28]。NH3-N 浓度降低意味着瘤胃中蛋白降解率的降低或者瘤胃微生物对NH3-N 利用率的提高[29]。本研究中当甜菜块根比例为40%时，NH3-N 浓度最低，此时MCP 浓度最高。甜菜块根比例小于40%时，甜菜块根比例的增加导致组合饲料中CP 也相应升高，同时为微生物提供了充足的氮源，微生物活性增强，微生物利用氨态氮合成自身蛋白的速度大于发酵底物产生氨态氮的速度，导致MCP 浓度升高，NH3-N 浓度降低。

饲粮中的碳水化合物通过瘤胃微生物的代谢作用，最终形成挥发性脂肪酸，是反刍动物主要的能量来源以及合成乳脂和体脂的重要原料[30]。本研究中当甜菜块根比例为40%时，TVFAs 和各挥发性脂肪酸浓度最高，当甜菜块根比例大于40%时，其浓度又呈现降低趋势，这主要与饲料中NSC/SC 有关，瘤胃中日粮的发酵产物及挥发酸浓度主要受日粮组成成分的影响[31]。饲粮组成中SC 含量较高时，瘤胃中的纤维降解菌活性增强，主要以乙酸发酵为主，饲粮组成中NSC 含量较高时，淀粉降解菌活性增强，同时抑制了纤维降解菌活性，主要以丙酸发酵为主，瘤胃液pH 较低。但是NSC 含量过高时，导致瘤胃内环境破坏，微生物发酵受到抑制，发酵产物浓度降低。

3.4 玉米秸秆黄贮与甜菜块根组合效应的综合评估

饲料组合效应是指不同来源的饲料通过营养互补后表现出来的整体效应。科学合理的饲料组合，可以最大限度地提高饲料的利用率[32]。因此，在选择合理的饲料组合时，要综合考虑消化率、整体发酵效果好的组合，主要对GP、NH3-N、VFA、MCP等多项指标进行综合评价，得出最优饲料组合[33-34]。本研究中，多项组合效应值结果为T3＞ T5＞ T4＞ T2＞T6，这也表明产生了不同的组合效应。当甜菜块根占组合中的40%时，产生了最大组合效应，说明玉米秸秆黄贮和甜菜块根组合比例为60 ∶ 40 时，整体发酵水平和消化利用率达到最大，为本研究的最优组合。