硼处理根瘤菌接种液对紫花苜蓿根、茎、叶中可溶性糖含量的影响

2021-07-28陈永岗师尚礼康文娟张辉辉李兴龙陈建刚

草业科学 2021年6期

陈永岗，师尚礼，吴芳，康文娟，张辉辉，阿芸，李兴龙，陈建刚

（甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州 730070）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是利用价值最高的豆科牧草之一，其在保持土壤水分以及作为动物饲料原料等方面具有重要作用[1]。根瘤菌可与苜蓿形成共生关系，在苜蓿根部结瘤固氮，还可以定殖于组织中[2]。但在苜蓿与根瘤菌的相互作用过程中，会诱发苜蓿的免疫反应，阻碍根瘤菌的侵入[3]，使部分根瘤菌难以与苜蓿形成共生关系。因此如何减弱宿主的防御反应，促进苜蓿与根瘤菌的侵染效率对于实际生产具有重要意义。而与外源菌相比，内生菌在与苜蓿建立共生关系时占有明显优势[4]，因此研究内源根瘤菌与外源根瘤菌侵染苜蓿以及侵染成功后在体内运移和定殖机理对于苜蓿和根瘤菌共生关系的建立有重要意义。

可溶性糖在植物体内的功能是多方面的，不仅参与调节植物生长、发育、抗性形成等多个生理过程，还参与胞内信号调节与转导过程[5]，对于苜蓿和根瘤菌共生关系建立具有重要作用。研究发现，可溶性糖在植物细胞结构和物质代谢中起着重要作用[6]。苜蓿植株体内根瘤菌定殖数量随植株光合产物源–库的运输方向呈逐渐增大的趋势[7]。微量元素在植物体内可溶性糖的运输、合成以及植物的生殖生长等过程中扮演重要角色[8]，其中硼元素是植物生长所必需的微量元素，缺乏或者过量都对植物的生长及其功能的发挥有很大的影响[7,9]。研究发现，缺硼不仅会影响植物叶片中碳水化合物的含量，同时还会影响碳水化合物在植物体内的转运和代谢[10-11]。而高硼，会抑制植物根的生长，降低植物体内蛋白质含量，同时影响糖的代谢途径[12]。硼的生理作用主要是易与植物组织中游离态的糖结合，使糖带有极性，易通过质膜，促进糖转运[13]。因此研究硼浓度对苜蓿接种根瘤菌后，不同取样时期苜蓿体内可溶性糖的变化对于研究硼处理根瘤菌接种紫花苜蓿影响和调整各组织中可溶性糖积累与重新分布有重要意义。

本研究拟以不同硼浓度处理内生荧光蛋白标记菌SinorhizobiummelilotiLZgn5f 菌液以及外源荧光蛋白标记菌S.meliloti12531f 菌液后，接种甘农5 号紫花苜蓿。研究不同硼处理内源外源根瘤菌培养液接种紫花苜蓿后，同一取样时期苜蓿根茎叶中可溶性糖含量的动态变化，以期筛选适宜的硼浓度，同时为硼处理根瘤菌接种紫花苜蓿影响和调整各组织中可溶性糖积累与重新分布规律及机理研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

根瘤菌：荧光标记外源根瘤菌S. meliloti12531f(12531f)，由甘肃农业大学教育部草业生态系统重点实验室提供，其原始菌株S. meliloti12531 购自中国科学院微生物保藏中心的中华苜蓿根瘤菌；荧光标记内源根瘤菌S. melilotiLZgn5f (gn5f)，分离自甘农5 号紫花苜蓿种子。

硼酸(H3BO3)：购自国药集团化学试剂有限责任公司，含量不少于99.5%。

培养基：采用TY 培养基进行菌株的活化、保存及培养。培养基配方如下：酵母粉 3 g·L-1，胰蛋白胨5 g·L-1，CaCl2·6H2O 1.33 g·L-1，蒸馏水 1 L，pH 7.0。固体培养基加琼脂16 g·L-1。

甘农5 号紫花苜蓿(Gangnong No.5)种子由甘肃农业大学教育部草业生态系统重点实验室提供，净度为97%，发芽率为86%。

营养液：Hoagland 有氮营养液[14]和Hoagland 无氮营养液[15]，以1 mol·L-1的HCl 溶液调节营养液pH至中性。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的配制

设置硼浓度梯度为0、0.05、1、5、10 和100 mg·L-1。将硼酸置于小烧杯中，在无菌操作台内紫外杀菌30 min 后，用无菌水溶解并过滤灭菌3 次。按浓度梯度将硼酸加入已配置好的40 mL TY 液体培养基中，设置3 个重复。

1.2.2 根瘤菌液的配置

根瘤菌菌液配制参考文献[16]的方法进行，即将斜面保存的两种荧光标记供试菌株（12531f 和gn5f）活化后接种到50 mL TY 液体培养基中，28 ℃，180 r·min-1培养至对数期，将两种菌液按10%浓度分别加入到1.2.1 已配置好的含有不同浓度梯度硼酸的40 mL TY 液体培养基中。将上述菌液培养至对数期后，转移至50 mL 离心管，10 000 r·min-1离心10 min，保留沉淀，加入等体积的无菌水，在旋涡震荡仪上充分打散，制成待用菌悬液，备用。

1.2.3 苜蓿培养

2018 年3 月- 6 月，在甘肃农业大学草业学院采用沙培法进行苜蓿培养。试验过程具体参考文献[16-17]的方法进行：选用清洗干净并高温灭菌的细沙，装入底部扎有小孔的塑料杯(直径9 cm，深11 cm)中，放入水培盒(长、宽和高分别为31、19 和10.5 cm)中。每杯播种45 粒甘农5 号紫花苜蓿种子(用碘伏浸泡3 min)，表面覆盖1.5 cm 灭菌细沙。未接种根瘤菌菌液前，每隔7 d 向水培盒中浇灌700 mL有氮营养液，发芽以前用无菌蒸馏水补充水分，保证幼苗的正常生长。

1.2.4 苜蓿根部根瘤菌接种

苜蓿根部根瘤菌接种参考文献[15]的方法进行：待紫花苜蓿幼苗长出真叶后，每杯定苗25 株，将上述4 种已配好的30 mL 菌悬液分别浇于上述对应盆栽表面，以单独浇灌等量无菌水处理为对照(CK)，每处理重复3 次。接种后每隔7 d 每盒浇灌700 mL 无氮营养液，分别在幼苗生长到30、60 和90 d时进行取样。

1.2.5 苜蓿各组织可溶性糖的测定

幼苗生长至30、60 和90 d 后每个处理随机选取5 株，擦净表面污物，将根、茎、叶分离，剪碎混匀。测定方法参考文献[18]的方法进行。

1.3 数据处理

采用SPSS 20 软件进行方差分析，并用Duncan法对各测定数据进行多重比较，显著性水平为0.05。用Excel 2010 软件进行数组处理以及作图，所有数据采用3 个重复的平均值 ± 标准误差表示。

2 结果与分析

2.1 硼处理根瘤菌接种液对不同取样时期苜蓿根、茎、叶中可溶性糖含量的影响

2.1.1 硼处理根瘤菌接种液对不同取样时期苜蓿根中可溶性糖含量的影响

不添加硼单独接种根瘤菌12531f 处理30 d 后，根中可溶性糖含量高出对照12.29%，随硼浓度的增加可溶性糖含量呈先降低后增加再降低的趋势，硼浓度为1 mg·L-1时，可溶性糖含量达最高，显著高出对照27.23% (P＜ 0.05)，但与单独接菌处理之间无显著差异(P＞ 0.05) (表1)；60 d 后，无硼添加组根中可溶性糖含量显著低于对照(P＜ 0.05)，可溶性糖含量随硼浓度的增加呈先上升再下降又上升的趋势，硼浓度为1 mg·L-1，可溶性糖含量最高，此浓度下，可溶性糖含量较对照和单独接菌处理显著提高了67.01%和92.93% (P＜ 0.05)；90 d 后，无硼添加组的根中的可溶性糖含量显著低于对照(P＜ 0.05)，随硼浓度的增加可溶性糖含量呈先上升再下降又上升的趋势，硼浓度为1 mg·L-1时，可溶性糖含量达最高，显著高出对照和单独接菌处理24.05%和62.50%(P＜ 0.05)。

表1 硼处理根瘤菌12531f 接种后苜蓿根茎叶中可溶性糖变化Table 1 Changes of soluble sugar in alfalfa roots, stems and leaves after inoculating 12531f with boron treatment

不添加硼单独接种根瘤菌gn5f 处理30 d 后，根中可溶性糖含量低于对照(P＞ 0.05)，随硼浓度的增加可溶性糖含量呈先上升再下降又上升的趋势(表2)，硼浓度为100 mg·L-1时，可溶性糖含量显著高于对照和单独接菌处理33.4%和45.56% (P＜ 0.05)；60 d后，根中可溶性糖含量较对照促进作用不显著(P＞ 0.05)，可溶性糖含量随硼浓度增加呈先上升后下降再上升的趋势，硼浓度为100 mg·L-1时，根中可溶性糖含量最高，显著高于对照和单独接菌处理57.18%和54.62% (P＜ 0.05)；90 d 后，根中可溶性糖含量显著高于对照14.96% (P＜ 0.05)，随硼浓度的增加可溶性糖含量呈先上升后下降又上升的趋势，硼浓度为100 mg·L-1时，根中可溶性糖含量最高，较对照和单独接菌处理显著提高26.98%和14.13%(P＜ 0.05)。

表2 硼处理根瘤菌gn5f 接种后苜蓿根茎叶中可溶性糖变化Table 2 Changes of soluble sugar in alfalfa roots, stems and leaves after inoculating gn5f with boron treatment

综上所述，1 mg·L-1硼处理接种外源菌12531f，更有利于根中可溶性糖的积累；100 mg·L-1硼处理内源菌gn5f 接种更有利于根中可溶性糖的积累。

2.1.2 硼处理根瘤菌接种液对不同取样时期苜蓿茎中可溶性糖含量的影响

不添加硼单独接种根瘤菌12531f 处理30 d 后，茎中可溶性糖含量显著高出对照30.26% (P＜ 0.05)，随着硼浓度的增加可溶性糖含量呈先增加后降低的趋势，硼浓度为1 mg·L-1时，茎中可溶性糖含量达最高，显著高出对照和单独接菌处理49.13%和27.05% (P＜ 0.05) (表1)；60 d 后，茎中可溶性糖含量低于对照(P＞ 0.05)，可溶性糖含量随硼浓度的增加呈先上升再下降又上升的趋势，硼浓度为1 mg·L-1时，茎中可溶性糖含量最高，显著高出对照和单独接菌59.85%和66.34% (P＜ 0.05)；90 d 后，茎中可溶性糖含量显著低于对照(P＜ 0.05)，随硼浓度的增加可溶性糖含量呈先下降后上升再下降又上升的趋势，硼浓度为100 mg·L-1时，茎中可溶性糖含量达最大，较对照和单独接菌处理显著高出16.87%和58.02%(P＜ 0.05)。

不添加硼单独接种根瘤菌gn5f 处理30 d 后，茎中可溶性糖含量显著高出对照47.24% (P＜ 0.05)(表2)，随硼浓度的增加可溶性糖含量呈先上升后下降再上升又下降的趋势，硼浓度为1 mg·L-1时，茎中可溶性糖含量达最高，显著高出对照和单独接菌处理59.56%和23.36% (P＜ 0.05)；60 d 后，茎中可溶性糖含量较对照促进作用不显著(P＞ 0.05)，随硼浓度增加呈先下降后上升再下降的趋势，硼浓度为5 mg·L-1时，茎中可溶性糖含量达最高，显著高出对照和单独接菌处理46.33%和39.49% (P＜ 0.05)；90 d 后，茎中可溶性糖含量低于对照(P＞ 0.05)，随硼浓度的增加可溶性糖含量呈先上升后下降又上升的趋势，硼浓度为100 mg·L-1时，茎中可溶性糖含量达最高，显著高出对照和单独接菌处理18.62%和22.17% (P＜ 0.05)。

上述结果表明，1 mg·L-1硼处理接种外源菌12531f有利于茎中可溶性糖的积累；100 mg·L-1硼处理接种内源菌gn5f 有利于可溶性糖在茎中的积累。

2.1.3 硼处理根瘤菌接种液对不同取样时期苜蓿叶中可溶性糖含量的影响

不添加硼接种根瘤菌12531f 处理30 d 后，叶中可溶性糖含量低于对照(P＞ 0.05)，随硼浓度的增加可溶性糖含量呈先上升后下降再上升的趋势，硼浓度为100 mg·L-1时，叶中可溶性糖含量最高，高出对照和单独接菌处理13.10%和29.24% (P＞ 0.05) (表1)；60 d 后，叶中可溶性糖含量显著高出对照41.45%(P＜ 0.05)，随硼浓度的增加可溶性糖含量呈先下降后上升的趋势，添加硼不利于可溶性糖在叶中积累；90 d 后，叶中可溶性糖含量低于对照(P＞ 0.05)，随硼浓度的增加可溶性糖含量呈先上升后下降的趋势，硼浓度为1 mg·L-1时，叶中可溶性糖含量达最高，显著高出对照和单独接菌处理7.63%和11.96%(P＞ 0.05)。

不添加硼接种根瘤菌gn5f 处理30 d 后，叶中可溶性糖含量高出对照16.19%，但不显著(P＞ 0.05)，随硼浓度的增加叶中可溶性糖含量呈先下降后上升再下降的趋势，硼浓度为1 mg·L-1时，叶中可溶性糖含量最高，显著高出对照和单独接菌处理40.70%和29.24% (P＜ 0.05)；60 d 后，叶中可溶性糖含量较对照促进作用不显著，随硼浓度增加可溶性糖含量呈先下降再上升又下降的趋势，硼浓度为1 mg·L-1时，叶中可溶性糖含量达最高，显著高于对照和单独接菌处理35.96%和26.4% (P＜ 0.05)；90 d 后，叶中可溶性糖含量显著高于对照62.49% (P＜ 0.05)，随硼浓度的增加可溶性糖含量呈先下降后上升又下降的趋势，添加硼不利于可溶性糖在叶中积累(表2)。

由上可知，硼处理接种菌株12531f 不利于叶中可溶性糖的积累；硼处理接种菌株gn5f 不利于叶中可溶性糖积累。

2.2 硼处理根瘤菌接种液接种苜蓿后同一取样时期根、茎、叶中可溶性糖含量变化

2.2.1 硼处理菌株培养液接种30 d 后苜蓿根、茎、叶中可溶性糖含量变化

硼处理两根瘤菌菌液接种30 d 后，苜蓿根、茎、叶中可溶性糖含量动态变化各不相同(表1、表2)。其中，硼处理根瘤菌12531f 接种30 d 后，当硼浓度小于1 mg·L-1时，更有利于促进可溶性糖向茎中积累，当硼浓度大于1 mg·L-1时，更有利于促进可溶性糖向根中积累，硼对叶中可溶性糖含量影响最小；硼处理根瘤菌gn5f 接种更有利于可溶性糖向茎中积累，当硼浓度为1 mg·L-1时促进作用最显著，硼浓度为100 mg·L-1时，更有利于可溶性糖向根中积累。

这表明，适宜的硼处理两菌株接种30 d 后，可以显著促进可溶性糖向根或茎中运输积累。

2.2.2 硼处理两菌株培养液接种60 d 后苜蓿根茎叶中可溶性糖含量动态变化

硼处理两根瘤菌12531f 和gn5f 菌液接种60 d 后苜蓿根茎叶中可溶性糖含量的变化各不同(表1、表2)。其中，接种不添加硼的12531f，更有利于可溶性糖向叶中积累，添加1 mg·L-1硼接种更有利于叶中可溶性糖向茎和根中运输和积累，当硼浓度大于5 mg·L-1时，硼对可溶性糖的变化影响逐渐减弱；当硼浓度小于1 mg·L-1时，接种根瘤菌gn5f，更有利于促进可溶性糖向叶中积累，当硼浓度为100 mg·L-1时，更有利于叶中可溶性糖向根和茎中运输积累。

上述结果表明，1 mg·L-1硼处理菌株12531f 和100 mg·L-1硼处理菌株gn5f 接种，均有利于可溶性糖向根和茎中运输积累。

2.2.3 硼处理两菌株接种90 d 后苜蓿根茎叶中可溶性糖含量动态变化

添加不同硼浓度的两根瘤菌接种液接种90 d后对苜蓿根、茎、叶中可溶性糖含量的动态变化影响各不相同(表1、表2)。其中，接种添加硼处理的根瘤菌菌株12531f，更有利于促进可溶性糖向根中运输积累，当硼浓度为1 mg·L-1时，促进用作最明显，当硼浓度为100 mg·L-1时，更有利于可溶性糖向茎中运输积累；不同硼浓度处理接种根瘤菌菌株gn5f 均可以促进可溶性糖向根中运输积累，但当硼浓度为100 mg·L-1时，更有利于向茎和根中运输积累，且促进作用最明显。

3 讨论

3.1 不同硼处理根瘤菌12531f 和gn5f 接种液接种30 d 后对苜蓿根、茎、叶中可溶性糖含量的影响

硼是植物生长发育和维持细胞壁结构以及功能发挥的必需微量元素[19]，其在植物生长发育过程中扮演者重要的角色，可以直接作用于细胞膜，并参与可溶性糖在植物体内的运输[20]。本研究中也发现适宜的硼处理两根瘤菌接种30 d 后，可以促进可溶性糖在根和茎中的积累，并且保持根、茎、叶中可溶性糖含量的动态平衡。这是因为适宜硼处理根瘤菌接种可以提高宿主体内与糖转运及合成有关酶的活性，继而促进可溶性糖在根和茎中合成和积累[21]，为植物生长提供能量。豆科植物根系是植物对硼和根瘤菌最敏感的部位，研究发现接种根瘤菌有利苜蓿根中可溶性糖的积累[22]，这与本研究结果一致。本研究发现接种30 d 时，外源根瘤菌根中可溶性糖含量高于对照，而内源菌低于对照，这可能是由于苜蓿根部对不同来源的根瘤菌的亲和力不同；也有可能是由于根瘤菌的群体效应所引起的[23]。1 mg·L-1硼处理12531f 和100 mg·L-1硼处理gn5f 培养液接种30 d时，更有利于根中可溶性糖的积累，表明不同的根瘤菌对硼浓度的敏感性不同[16]，同时硼可以提高根部氧气含量，促进根系生长[24]，有利于糖分的积累，促进果实生长[25]。曾小红等[26]也发现不同来源的根瘤菌对植物组织中代谢产物含量影响有差异。

3.2 不同硼处理根瘤菌12531f 和gn5f 培养液接种60 d 后对苜蓿根、茎、叶中可溶性糖含量的影响

可溶性糖是绿色植物碳代谢的重要产物，可间接反映植物光合作用能力与碳代谢的关系，硼对光合产物在植物体内的分配和运转起着重要作用，同时可以调节植物各组织中有机物质的供应[27]。本研究中也发现，适宜硼处理两菌株接种苜蓿60 d 后，可以促进可溶性糖在根和茎中的积累，这可能是由于苜蓿在该时期光合作用较强，合成的可溶性糖较多，从而使大量的可溶性糖从叶中被运输到根、茎中积累而产生的结果；刘金燕[12]研究发现硼浓度对小麦(Triticum aestivuml)根影响的差异蛋白主要是参与转录、蛋白质翻译和加工以及糖代谢等途径相关的蛋白，继而调控与糖代谢有关的代谢通路。接种根瘤菌与对照相比，接种12531f 的根和茎中可溶性糖含量低于对照，而内源菌gn5f 高于对照，表明内源外源根瘤菌对根和茎中可溶性糖的积累影响不同。这可能与根瘤菌在植物体内运移和定殖的数量有关[16]，同时李莎莎等[22]研究也发现接种根瘤菌有利苜蓿根内可溶性糖的积累。

本研究还发现，添加不同硼浓度的内源菌和外源菌接种液接种苜蓿对根和茎中可溶性糖积累影响不同，可能是因为不同的根瘤菌对硼的敏感性不同，继而影响库源之间化合物的运输[28-29]，最终导致苜蓿根、茎、叶中可溶性糖含量的动态变化不一致。

3.3 不同硼处理根瘤菌12531f 和gn5f 接种液接种90 d 后对苜蓿根、茎、叶中可溶性糖含量的影响

本研究发现，接种90 d 时，硼处理培养液有利于内源根瘤菌gn5f 叶中可溶性糖的积累，是由于内源菌侵染效率比外源菌高[16]，易于在苜蓿体内运移定殖，此外，不同来源的根瘤菌对叶中可溶性糖的作用也不相同[26]，因而内源根瘤菌对苜蓿叶中可溶性糖积累影响较大。1 mg·L-1硼处理外源菌12531f和100 mg·L-1硼处理内源菌gn5f 接种液接种时，更有利于促进苜蓿根、茎中可溶性糖的积累，刘鹏[30]研究发现，适量的硼能明显减少可溶性糖在功能叶中的积累，促进光合产物从叶向茎的运输，茎中可溶性糖含量增加[31]，这可能是导致本研究不同硼浓度处理两菌株接种90 d 后，产生不同结果的部分原因。同时高硼会抑制叶中可溶性糖的积累，可能是因为硼影响植株硼糖络合物形成进而影响碳水化合物的运输而引起的[32]；也可能是由于高硼胁迫使叶片部分细胞膜结构和功能受损，从而生成大量可溶性糖来调节渗透压平衡[7,33]，导致叶中可溶性糖含量减少。具体机制有待进一步研究。

由上述可以得出，植物组织中可溶性糖代谢途径是一个复杂的生理生化过程，硼和根瘤菌处理均对其含量有一定的影响，适宜的硼处理根瘤菌接种有利于可溶性糖在苜蓿根和茎中积累，不同的根瘤菌对苜蓿体内可溶性糖的积累影响不同。本研究初步探究了添加不同硼浓度的内源外源根瘤菌接种液接种甘农5 号紫花苜蓿后，在不同取样时期苜蓿根茎叶中可溶性糖含量的动态变化，为硼处理根瘤菌接种紫花苜蓿影响和调整各组织中可溶性糖积累与重新分布规律及机理研究提供理论依据。