外源MeJA 对紫花地丁生长及其生理生化的影响

李巧峡，潘朝朝，黄小霞，李纪纲，张正蓉，王 勃

（西北师范大学生命科学学院, 甘肃 兰州 730070）

茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)是一种茉莉酸(jasmonic acid，JA)类似物，作为一种重要的天然植物生长调节剂，其广泛地存在于植物体中，在植物生长发育以及抗胁迫中发挥着重要的作用[1]，目前，已有大量研究证实，当植物处于病虫害、高温、低温、干旱、盐碱、重金属胁迫等逆境条件下时，外源喷施MeJA，其作为一种信号分子通过气孔进入植物体内[2]，在细胞质中被酯酶水解为有生物活性的茉莉酸，大量茉莉酸与异亮氨酸形成复合物JA-Ile (jasmonoyl-isoleucine)，使植物体内茉莉酸及其衍生物的含量显著增加，进而诱导一系列与抗逆相关基因的表达，如蛋白酶抑制剂、苯丙氨酸转氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)、脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)等，使植物体内产生一些防御性化学物质，如渗透调节物质、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase,POD)、 过氧化氢酶(catalase, CAT)、 脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)活性变化等。有关植物抗逆性研究表明外施MeJA 在一定程度上能减缓各种生物与非生物胁迫对植物造成的伤害[3]，有效地提高植株的抗逆能力[4-5]，随着MeJA 在植物抗逆机制中重要作用的揭示，其防御方面的作用研究也得到人们的广泛关注，生物与非生物胁迫下外施MeJA 对植物生长调节作用和生理特性的研究，已在多种植物中有报道，如月季(Rosa chinensis)[6]、狭叶黄芩(Scutellaria regeliana)[7]、小麦(Triticum aestivum)[8]、草地早熟禾(Poa pratensis)[9]、 金叶银杏(Ginkgo biloba)[10]、柑橘(Citrus reticulata)[11]等。

紫花地丁(Viola philippica)属于堇菜科堇菜属多年生草本植物，在我国除青海、西藏外其他各省区均有分布，因其具有很好的抗氧化[12]、抗菌[13]、抗炎[14-15]、抗癌[16]、抗病毒[17]等功效，被广泛用于医药、食品等方面。同时，紫花地丁具有抗盐、抗干旱以及花型优美、花色鲜艳等特性，被广泛用于园艺栽培等方面。但是，紫花地丁在生长过程中，如果在温度过高或通风不良的情况下，叶片表面易长叶螨，严重影响紫花地丁的生长发育。目前，在其他植物中已发现MeJA 具有提高植物防御能力的积极作用，但是对紫花地丁生长发育及抗逆能力是否有提高还未见报道。因此，本研究以紫花地丁为材料，通过探究外源喷施不同浓度MeJA 对紫花地丁生长及生理生化的影响，为紫花地丁的合理栽培及抗逆机制研究等方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为紫花地丁种子，采自甘肃省省委党校草坪，成熟的蒴果装与信封袋中让其自然风干，然后与4 ℃下保存待用。

1.2 试验设计

挑选颗粒饱满的紫花地丁种子，播种至穴盘中，当其种子萌发并有4 片真叶后，进行移栽，将幼苗移栽至营养土 ∶ 蛭石 = 3 ∶ 1 (体积比)的塑料花盆中，每盆中移栽2 株幼苗，将幼苗放置在光暗周期比为12 h/12 h (时控开关控制)、温度为22～28 ℃、湿度为48%、光照强度为9 600 lx 的培养架上进行生长。待其生长稳定，至少发育有6 片真叶时，每周在紫花地丁幼苗叶片的下表皮喷施不同浓度的MeJA (0、1.25、2.5、5、10 mmol·L-1)。每个浓度下8盆，设3 个独立的生物学重复。

1.3 螨害指数和诱抗效果

喷施外源MeJA 第7 周后观察并统计紫花地丁受叶螨侵染的各级叶片数，并计算螨害指数与诱抗效果，取3 个独立的生物学重复。参照吴委林等[18]的方法，根据植株受螨害的程度将其分为0、1、2、3、4 级，0 级：叶片未受螨害，植株生长正常；1 级：叶片表面出现少量淡黄色小斑点，受害轻微，螨害面积占叶片面积的25%以下；2 级：叶面出现黄色斑，黄斑面积占叶片面积的26%～50%；3 级：叶面黄褐斑较多成片，黄褐斑面积占叶片面积的51%～75%，叶片局部卷缩；4 级：叶片受害严重，黄褐斑面积占叶片面积76%以上，严重时叶片枯萎、脱落。

计算紫花地丁叶片的螨害指数与诱抗效果：

1.4 生长指标测定

紫花地丁幼苗叶片数、叶柄长、叶长、叶宽净生长的测定：先对MeJA 处理前植株的叶片数、叶柄长、叶长、叶宽进行测定。计数叶片数量，使用刻度尺测定其叶柄长、叶长、叶宽，数值精确到mm。然后，不同浓度的MeJA 处理7 周后，再对紫花地丁植株的生长指标进行测定，处理前后各生长指标的差值即为紫花地丁幼苗叶片数、叶柄长、叶长、叶宽的净生长值。

1.5 抗氧化酶活性测定

取紫花地丁幼苗叶片0.2 g，洗净后置于提前预冷的研钵中，分3 次将0.05 mol·L-1pH 7.8 的磷酸缓冲液0.6、0.5 和0.5 mL 加入到预冷的研钵中，在冰上研磨成匀浆，转入离心管，在4 ℃、12 000 r·min-1离心20 min，取上清，上清液即为粗酶液，将粗酶液储存在4 ℃冰箱中待测定。取3 个独立的生物学重复。氮蓝四唑(NBT)法测定紫花地丁叶片中SOD的活性[19]， 愈创木酚法测定POD 活性[20]， 紫外吸收法测定CAT 活性[21]。

1.6 MDA 含量的测定

参照Bailly 等[22]的方法，利用硫代巴比妥酸法测定MDA 的含量。

1.7 LOX 活性的测定

参照王祎等[23]的方法，采用紫外分光光度法测定LOX 酶活性。

1.8 叶绿素含量的测定

采用分光光度法参照Arnon 方法[24-25]，并作部分修改，采用丙酮提取法测定紫花地丁叶片中叶绿素的含量。

1.9 可溶性糖含量的测定

参照李合生[26]的方法，利用蒽酮比色法测定紫花地丁叶片中可溶性糖含量。

1.10 数据处理

利用SPSS 17.0 分析软件在P＜ 0.05 水平下统计分析不同浓度的MeJA 溶液对紫花地丁生长指标及生理指标的数据，用平均值 ± 标准误差表示测定结果，数据用Origin 2018 进行绘图。

2 结果与分析

2.1 外源MeJA 对紫花地丁抗叶螨的影响

与对照组(CK)相比，外源喷施不同浓度的MeJA溶液后，紫花地丁叶片表面侵染的叶螨数量减少，螨害指数明显降低(P＜ 0.05)。且随着MeJA 浓度的升高，植株抗螨能力升高，当其浓度在10 mmol·L-1时，植株几乎无叶螨侵染，螨害指数为0.16，抗螨效果达到99.68% (表1)。

表1 外源不同浓度的MeJA 对紫花地丁抗叶螨的影响Table 1 Effect of different concentrations of exogenous MeJA on the resistance of Viola philippica to spider mites

2.2 外源MeJA 对紫花地丁营养生长的影响

外源喷施不同浓度的MeJA溶液，随着MeJA 浓度的升高，与对照组(CK)相比，紫花地丁植株的叶片宽、叶片长、叶片数和叶柄长均先增加后减少，且都在浓度为2.5 mmol·L-1时达到最大值，与对照组相比，分别显著增加了20.20%、23.39%、50.30%和23.99% (P＜ 0.05) (图1)。

图1 外源不同浓度的MeJA 对紫花地丁营养生长的影响Figure 1 Effect of different concentrations of exogenous MeJA on the vegetative growth of Viola philippica

2.3 外源MeJA 对紫花地丁叶片抗氧化酶活性的影响

外源喷施不同浓度的MeJA 溶液，紫花地丁叶片中SOD、POD、CAT 的活性均呈现一致的变化，随着MeJA 浓度的升高，3 种酶的活性都升高(图2)，当浓度为10 mmol·L-1时，SOD、POD、CAT 的酶活性最高，与对照组(CK)比较，紫花地丁叶片中SOD、POD、CAT 的活性分别提高了136.36%、66.90%、124.19%，说明高浓度的外源MeJA 更能够显著地提高紫花地丁叶片中SOD、POD、CAT 的酶活性(P＜ 0.05) 。

图2 外源不同浓度的MeJA 对紫花地丁抗氧化酶活性的影响Figure 2 Effect of different concentrations of exogenous MeJA on the antioxidant enzyme activities of Viola philippica

2.4 外源MeJA 对紫花地丁叶片中MDA 含量和LOX 活性的影响

MDA 是膜脂过氧化的产物，具有细胞毒性，会破坏细胞膜结构，因此其含量高低可以衡量膜脂过氧化的程度。与对照组(CK)相比，随着外源MeJA溶液浓度的升高，紫花地丁叶片中的MDA 含量呈现逐渐降低的趋势(图3)。在MeJA浓度达到10 mmol·L-1时，MDA 含量最低，比对照组显著降低了44.87% (P＜ 0.05)，表明高浓度的MeJA 溶液能够减缓紫花地丁叶片中膜脂过氧化的程度。随着MeJA浓度的升高，紫花地丁叶片中脂氧合酶(LOX)活性逐渐升高，与对照组相比，1.25、2.5、5 和10 mmol·L-1浓度处理的LOX 活性分别显著提高了14.29%、24.49%、46.94%和87.76% (P＜ 0.05)，其中10 mmol·L-1处理的增幅最大。结果表明，外源喷施高浓度的MeJA 溶液，可显著提高紫花地丁叶片中的LOX 活性。

图3 外源不同浓度的MeJA 对紫花地丁叶片中丙二醛含量和脂氧合酶活性的影响Figure 3 Effect of exogenous MeJA concentrations on malondialdehyde content and lipoxygenase (LOX) activity in leaves of Viola philippica

2.5 外源MeJA 对紫花地丁叶片叶绿素和可溶性糖含量的影响

叶绿素是衡量光合作用的重要指标，喷施不同浓度的MeJA 后，紫花地丁叶片中叶绿素含量较对照组均呈增加趋势(图4)。与对照组(CK)相比，1.25、2.5、5 和10 mmol·L-1浓度处理分别增加了3.07%、5.66%、14.72%和22.62%；随着外源MeJA 浓度的升高，与未喷施MeJA 组相比，紫花地丁叶片中可溶性糖含量也逐渐升高，当MeJA 浓度达到10 mmol·L-1时，可溶性糖含量最高，与对照组相比，增加了58.57%。

图4 外源不同浓度的MeJA 对紫花地丁叶片叶绿素和可溶性糖含量的影响Figure 4 Effect of exogenous MeJA concentrations on the chlorophyll and soluble sugar content in leaves of Viola philippica

3 讨论

MeJA 作为一种植物生长调节物质，可以促进植株生长发育，提高植物的抗虫能力等。研究表明[27]苹果树(Malus pumila)喷施适宜浓度的MeJA溶液可以充当杀螨剂的作用，进而有效地防治蜘蛛螨对果树的病害，Mageroy 等[28]用MeJA 喷洒云杉(Picea abies)的树皮，结果发现云杉对杀树甲虫及其相关的植物病原真菌的抵抗力增强。孙灿[29]用不同浓度MeJA 处理黄瓜(Cucumis sativus)和葎草(Humulus japonicus)，随着MeJA 溶液浓度的增加，植物叶片的叶长、叶宽、叶柄长、叶片数量、叶面积均增加。何伟伟等[30]设置了4 个不同浓度的MeJA 浸种处理玉米(Zea mays)籽粒，结果发现MeJA 浓度为0.5 μmol·L-1时，玉米籽粒发芽率和芽长达到最大值。晏姿等[31]用不同浓度MeJA 溶液浸泡种球及喷施香雪兰(Freesia hybrida)，发现MeJA溶液促进了香雪兰株高的生长。这些研究结果表明，MeJA 可以诱导植物的抗虫性，促进植物种子萌发及植物的生长。本研究结果与上述研究一致，MeJA 也能增加紫花地丁植株对叶螨的抵抗力，同时促进紫花地丁的生长发育。

外源喷施MeJA 可有效提高植物的抗逆境与抗病虫害的能力，主要机制在于可直接影响与植物抗逆相关的一些生理指标，如SOD、POD、CAT、LOX等酶活性，以及MDA 含量和渗透调节物质的含量等。SOD、POD、CAT 是植物抗氧化酶系统的重要组成部分，在各种生物与非生物胁迫下，植物体内会产生大量活性氧自由基，SOD 可以将这些有毒物质的活性氧自由基转化为H2O2，然后由POD 和CAT将过量的H2O2转变成水和氧气，从而有效缓解逆境对植物的伤害[32]。MDA 是膜质过氧化物的产物，可以破坏细胞膜结构，能反映植物受伤害的程度[33]，本研究结果表明随着外源MeJA 浓度的增加，SOD、CAT、POD 活性均呈上升趋势，MDA 含量降低，这与在其他植物[34-36]中的研究结果一致，说明MeJA可以通过增加紫花地丁中SOD、CAT、POD 的活性，使植物细胞内的过氧化物及时清除，减少细胞膜脂过氧化，从而有效缓解叶螨对紫花地丁的伤害，提高紫花地丁的抗逆性。LOX 存在于植物的叶绿体膜中，在逆境胁迫下参与茉莉酸的合成，其活性的高低影响植物内源茉莉酸类物质水平，与植物的防御状态密切相关。巩莎[37]用MeJA 处理枣树(Ziziphus jujube)，发现MeJA 能显著提高LOX 等防御酶活性，且枣树上日本龟蜡蚧(Ceroplastes japonicas)雌成虫蜜露排泄量减少，表明MeJA 作为外源信号分子可以增强枣树对害虫的抵抗性。这与本研究结果一致，说明外源茉莉酸甲酯可以增强紫花地丁植株抗氧化酶活性和LOX 防御酶活性，有效增加植物的防御能力。

外源MeJA 可通过影响植物的渗透调节物质、光合作用强度来提高植物的抗逆性，可溶性糖是植物重要的渗透调节物质之一，研究表明植物中可溶性糖含量越多，植株抗逆能力越强[38]。叶绿素含量可以反映植物的光合作用强度，在一定程度上叶绿素含量越高，植株光合作用越强，逆境胁迫会使植物叶片叶绿素含量降低而影响光合作用。在本研究中，经MeJA 处理后的紫花地丁可溶性糖含量和叶绿素含量均高于对照组，说明MeJA 处理后可显著缓解螨害胁迫对紫花地丁造成的不良影响。邬亚红[39]研究发现用茉莉酸甲酯喷施辣椒(Capsicum annuum)后，辣椒叶片中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量及可溶性糖含量随着茉莉酸甲酯浓度的升高呈现上升趋势，辣椒叶片上的烟粉虱(Bemisia tabaci)的种群数量迅速下降。另外，研究发现用1.5 mmol·L-1的MeJA 处理接种白粉病的草地早熟禾(Poa pratensis)，结果发现白粉病斑面积减少，植株的植株体内的叶绿素含量和可溶性糖的含量均增加[9]。因此，结合前人研究与本研究结果，表明MeJA 也可通过增加紫花地丁植株渗透调节物质和叶绿素含量来提高其对叶螨的抵抗力。

4 结论

本研究结果表明，叶面喷施适宜浓度的MeJA能增加紫花地丁对叶螨的抵抗力，减少病害，促进紫花地丁的生长发育，当MeJA 的浓度为2.5 mmol·L-1时，叶片数量、叶柄长、叶宽、叶长达到最大值；外源MeJA 浓度的升高，可以显著增加CAT、POD、SOD、LOX 活性及叶绿素和可溶性糖的含量，紫花地丁的MDA 含量随着外源MeJA 浓度的增高，而呈现逐渐降低的趋势，在10 mmol·L-1时达到最低。这些结果表明外源喷施MeJA 通过影响各种酶活性及相应生理指标，提高了紫花地丁对叶螨的抵抗性，从而有利于植物的生长发育。本研究为以后研究紫花地丁的合理栽培及抗逆机制研究等方面提供理论依据。