GDF15激活ERK/Bcl-2通路增强BM-MSCs放射抗性

吴 春，张小梅，向 阳，冉 茜，李忠俊*，张克斌

1陆军军医大学第二附属医院检验医学中心（输血科）放射生物学实验室，2临床医学研究中心，重庆 400037

随着放射技术在军事、医药和其他行业的大量应用，急性放射综合征（acute radiation syndrome，ARS）的研究也越来越受到人们的重视。放射造成造血系统损伤，导致骨髓造血功能障碍，严重时可危及生命。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）作为骨髓造血微环境的重要组成部分，其自身及其后代子细胞可为造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）提供物理支撑。此外，BM-MSCs也可通过分泌多种造血/细胞因子，对HSCs 的自我更新、分化及骨髓定植均发挥重要作用［1-3］。目前认为，相较于HSCs，BM-MSCs具有较强的放射抗性，其相关的放射抗性机制主要包括：DNA损伤的有效识别，双链断裂修复及细胞凋亡逃逸等，但目前其具体机制尚未被完全阐明［4］。鉴于BM-MSCs的存活可为放射损伤后造血重建提供基质干细胞基础，因此，深入研究其放射抗性机制，对探索骨髓型急性放射病救治的新策略具有重大意义。

生长分化因子15（growth differentiation factor 15，GDF15）是转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）超家族中的一员，在各种细胞和组织中广泛分布，伴随着不同的应激反应，如炎症、心脏缺血再灌注、急性组织损伤、放射、癌症等，GDF15的表达会大幅增加［5-9］。既往研究表明，GDF15在部分癌细胞中高表达，并且在癌症的不同进展阶段具有促凋亡和抗凋亡两种效应［10-12］。本课题组前期研究结果显示，BM-MSCs 放射后，GDF15 的表达显著升高［13］，其是否在BM-MSCs的放射抗性中发挥关键作用，目前尚不清楚。本研究考察了放射后上调的GDF15表达在BM-MSCs放射抗性中的作用，并初步探讨了其可能作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人BM-MSCs、人BM-MSCs 培养基（ScienCell 公司，美国），人GDF15 干扰片段（广州锐博生物科技有限公司），逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒（大连宝生物工程有限公司），Western blot转膜液、一抗稀释液、二抗稀释液、封闭液、RIPA 细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶电泳配制试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒JC-1（上海碧云天生物技术有限公司），PCR 引物（上海生工生物工程股份有限公司），PI staining 检测试剂盒、Annexin V-PE/7AAD 凋亡检测试剂盒（BD 公司，美国），CCK-8（同仁化工，日本），Lipofectamine 3000试剂（Invitrogen 公司，美国），GDF15、p-ERK1/2、ERK1/2 抗体（Abcam 公司，美国），Caspase3、Cleaved caspase3 抗体（CST 公司，美国），Bcl-2、Bax、β-actin抗体（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

BM-MSCs使用专用BM-MSCs培养基培养，原代细胞复苏于T-75 细胞培养瓶中，37 ℃，5%CO2的培养箱中培养，视为P1代细胞。细胞融合度达到85%～90%，1∶3传代为P2代细胞。本研究使用P6～P10代细胞进行后续细胞实验。

1.2.2 细胞分组及放射处理

实验分为3组：空白对照组、干扰对照组和干扰GDF15组。采用Co-60 γ射线对细胞进行放射处理，处理剂量为9 Gy，剂量率为0.65 Gy/min［14］。

1.2.3 GDF15 siRNA干扰片段转染BM-MSCs

取对数生长期的细胞，接种于6孔板中，融合度在70%。按Lipofectamine 3000 试剂说明书的比例配比各试剂，室温孵育15 min，加入6 孔板中，24 h后收集细胞检测mRNA 的表达，72 h 后收集细胞检测蛋白的表达。GDF15干扰片段靶序列如下：干扰片段1：5′-CCATGGTGCTCATTCAAAA-3′；干扰片段2：5′-GACTCCAGATTCCGAGAGT-3′；干扰片段3：5′-CCAACTGCTGGCAGAATCT-3′。

1.2.4 蛋白免疫印迹分析（Western blot）检测蛋白表达

收集细胞，PBS洗1次，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白；冰上裂解30 min，10 000g4 ℃离心15 min，收上清；BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定，加入1/5体积蛋白上样缓冲液，煮沸10 min，使蛋白变性。根据目的蛋白分子量配制浓度为12%的SDS-PAGE凝胶，按照30 μg总蛋白上样，100 V 电泳，200 mA 转膜；5%BSA 室温封闭1 h，一抗孵育4 ℃过夜，抗体使用浓度：GDF15抗体（1∶1 500）、p-ERK1/2、ERK1/2、Caspase3、Cleaved caspase3、Bcl-2、Bax、β-actin 抗体（1∶1 000），TBST 洗膜3 次，二抗室温孵育2 h，洗膜3次，ECL显影曝光并拍照，实验重复3次。

1.2.5 RT-qPCR检测mRNA水平

收集细胞，每管加入1 mL TRIzol试剂提取细胞总RNA，移液枪反复吹打直至无明显沉淀，室温裂解30 min；加入上述裂解液体积1/5 的氯仿，涡旋室温静置15 min，10 000g4 ℃离心15 min；取上层无色液体转移至新的无酶EP管中，向上述无色液体中加入同等体积异丙醇，混匀室温静置10 min，10 000g4 ℃离心10 min，弃上清；加入800 μL 75%乙醇清洗沉淀，7 500g4 ℃离心10 min，弃上清，室温干燥沉淀；加入20 μL DEPC 水，溶解RNA，测RNA 浓度。按照TaKaRa 的逆转录试剂盒说明书操作步骤反转录得到cDNA，进行RT-qPCR。引物序列：GDF15上游：5′-GACCCTCAGAGTTGCACTCC-3′，下游：5′-GCCTGGTTAGCAGGTCCTC-3′；β-actin 上游：5′-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3′，下游：5′-CTGGTGCCTGGGGCG-3′，每组3个复孔，实验重复3次。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期细胞，1.5×105个/孔接种于6孔板中，接种24 h后转染各组细胞；9 Gy放射处理，24 h后收集细胞，1 000 r/min 离心5 min，冰PBS 清洗3 次；根据凋亡检测试剂操作说明书，按照每孔100 μL 结合液，5 μL Annexin V-PE 和5 μL 7-AAD 配制检测液，分别加入各组细胞中，重悬混匀，室温避光孵育15～30 min，流式细胞仪检测，每组3个复孔，实验重复3次。

1.2.7 流式细胞仪检测细胞周期

取对数生长期细胞，接种于25 cm2细胞瓶中，细胞融合度达60%转染各组细胞；9 Gy放射处理，24 h后收集细胞，1 000 r/min 离心5 min，PBS 清洗3 次，75%冰乙醇固定，4 ℃冰箱过夜；PBS 洗3 次，PI 染色，重悬混匀，室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测，每组3个复孔，实验重复3次。

1.2.8 CCK-8检测细胞增殖

取对数生长期细胞，2 000 个/孔接种于96 孔板中，24 h 后转染各组细胞，9 Gy 放射处理；72 h 后弃培养基，按照每孔100 μL培养基，10 μL CCK-8试剂配制检测液，分别加入96 孔板中，37 ℃避光孵育2 h，酶标仪450 nm 检测吸光度，每组5 个复孔，实验重复3次。

1.2.9 免疫荧光染色

取对数生长期细胞2×104个/孔接种于激光共聚焦皿中，24 h 后转染各组细胞，9 Gy 放射处理；分别收取未放射、放射后8 h和放射后24 h 3个时间点细胞；弃培养基，PBS洗1次，37 ℃4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗3次；0.2%Triton X-100破膜30 min，PBS 洗3 次：5% BSA 封闭1 h；GDF15 一抗（1∶200）4 ℃孵育过夜，PBS 洗3 次；二抗37 ℃避光孵育3 h，PBS 洗3 次；DAPI 染色10 min，室温避光，PBS 洗3次；抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察拍照，实验重复3次。

1.2.10 线粒体膜电位检测

取对数生长期细胞，2×104个/孔接种于24 孔板中，24 h 后转染各组细胞，9 Gy 放射处理；分别收取未放射、放射后8 h 细胞。阳性对照设置：阳性对照孔中加入碳酰氰基-对-氯苯腙（CCCP，使用浓度为10 μmol/L）处理细胞20 min。吸除培养基，PBS洗1 次，加入500 μL JC-1 染色工作液，细胞培养箱中孵育20 min；吸除上清，PBS 洗2 次，加入1 mL 细胞培养液，荧光显微镜观察拍照，实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，实验计量数据以均数±标准差（）表示。同一测量值在不同的时间比较采用重复测量的方差分析；两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，方差不齐数据采用Tamhane’s T2检验进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 放射诱导BM-MSCs中GDF15表达上调

为明确放射后BM-MSCs中GDF15的表达情况，分别通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光检测细胞经放射处理后不同时间点GDF15 的mRNA 和蛋白表达水平。结果显示，GDF15 的mRNA 和蛋白水平在放射后显著升高（图1A、B）。同时，免疫荧光的结果也证实，放射可诱导GDF15 的表达增加（图1C）。综上，在BM-MSCs 细胞经放射诱导后GDF15的表达上调。

图1 BM-MSCs经放射后GDF15的表达情况Figure 1 The expression of GDF15 in BM-MSCs after irradiation

2.2 GDF15干扰效果验证

为明确放射后高表达的GDF15 在BM-MSCs 放射抗性中的作用，我们采用脂质体转染siRNA 片段干扰GDF15 的表达，并于细胞转染24 h 后，进行mRNA 检测。结果显示，与干扰对照组相比，3个干扰片段均能有效降低GDF15 的mRNA 表达水平（P＜0.05，图2A），其中干扰片段1 的mRNA 抑制效率达到75%；细胞转染72 h后，进行蛋白检测，结果显示，与干扰对照组相比，3个干扰片段均能有效降低GDF15 蛋白表达（P＜0.05，图3B、C）。综合上述结果，干扰片段1的抑制效果最好，并拟采用此片段进行后续的干扰实验。

图2 RT-qPCR和Western blot验证GDF15干扰效果Figure 2 The interference effect of GDF15 in BM-MSCs were detected by RT-qPCR and Western blot

2.3 干扰GDF15的表达可降低BM-MSCs放射后细胞增殖

为明确GDF15 表达水平对放射前后细胞增殖的影响，我们检测了细胞周期和细胞增殖活力。收取未放射和放射后24 h 的BM-MSCs 细胞，通过PI染色检测细胞周期，结果显示，未放射条件下，干扰GDF15 对BM-MSCs 周期无明显影响；放射后24 h时，干扰GDF15 组G2 期比例显著增加（P＜0.05，图3A、B）。收取放射3 d后的细胞，CCK-8法检测细胞增殖活力，结果显示与细胞周期结果相符，干扰GDF15几乎不影响未放射时的细胞增殖活力，却可导致放射后BM-MSCs 细胞增殖活力显著降低（P＜0.01，图3C）。综上所述，干扰GDF15基因表达可导致放射后BM-MSCs细胞G2期阻滞并且降低细胞增殖活力。

图3 干扰GDF15抑制BM-MSCs放射后细胞周期及增殖Figure 3 GDF15 interference inhibited the cell cycle and proliferation of BM-MSCs after irradiation

2.4 干扰GDF15表达可增加BM-MSCs放射后细胞凋亡

为进一步明确GDF15 表达对BM-MSCs 放射抗性的影响，我们通过Annexin V-PE/7AAD 染色及检测Cleaved caspase3 和JC-1 变化水平，明确干扰GDF15 表达对BM-MSCs 放射后细胞凋亡的影响。检测结果如图4A、B 所示，未放射条件下，干扰GDF15 表达对细胞的凋亡无显著性影响。而放射后，干扰GDF15 可导致细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）。与之相应，Cleaved caspase3 的Western blot结果证实，干扰GDF15可使放射后Caspase3的剪切水平增加（图4C）。同时，检测JC-1细胞线粒体膜电位的变化情况发现，在未放射条件下，对照组与干扰GDF15 红/绿荧光强度比值无统计差异（P＞0.05）。而放射后，干扰GDF15组与其干扰对照组相比，红/绿荧光强度比值显著降低，提示线粒体膜电位下降（P＜0.001，图5）。上述结果表明，干扰GDF15表达可显著增加BM-MSCs细胞放射后凋亡。

图4 干扰GDF15对BM-MSCs放射前后细胞凋亡的影响Figure 4 The effects of GDF15 interference on the apoptosis of BM-MSCs before and after irradiation

图5 干扰GDF15后BM-MSCs放射前后线粒体膜电位变化Figure 5 The effect of GDF15 interference on mitochondrial membrane potential of BM-MSCs before and after irradiation

2.5 干扰GDF15表达可抑制BM-MSCs 的ERK/Bcl-2信号通路活化

为进一步明确干扰GDF15 表达增加BM-MSCs放射敏感性的分子机制，我们检测了GDF15下游与细胞凋亡密切相关的关键通路ERK/Bcl-2的活化情况［15］。Western blot检测结果表明：与空白对照组和干扰对照组相比，干扰GDF15 后，ERK1/2 磷酸化水平明显降低，表明GDF15 可以通过增加ERK1/2 的磷酸化调节其下游蛋白的表达。与对照组相比，干扰GDF15导致抗凋亡关键分子Bcl-2蛋白水平明显降低，而促凋亡分子Bax 蛋白水平明显升高（图6）。综上所述，干扰GDF15表达可通过抑制ERK信号通路活化，调节下游Bcl-2 和Bax 蛋白表达，进而增加BM-MSCs放射后凋亡。

图6 干扰GDF15后BM-MSCs放射后ERK及其下游蛋白的表达Figure 6 The effect of GDF15 interference on ERK and its downstream proteins of BM-MSCs after irradiation

3 讨论

在ARS的研究中，骨髓造血损伤是各种放射病最基本和最致命的表现之一，并贯穿各型ARS的始终［16］。因此，对于骨髓造血功能损伤的防治是ARS防治的关键和重要研究领域。BM-MSCs 是一类具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，可以分化为包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞和成纤维细胞在内的骨髓基质细胞，以形成HSCs 骨髓内定植的龛位，也可分泌多种造血因子、细胞因子和趋化因子建立细胞因子网络，对于正常造血功能的维持和损伤后造血重建都至关重要［17］。因此研究BMMSCs的放射抗性，对于造血重建具有重大意义。

凋亡是放射诱导细胞死亡的主要原因之一，而BM-MSCs 对凋亡的抗性被认为是放射耐受的关键机制。已有研究表明，放射后BM-MSCs的抗凋亡作用与较强的DNA 损伤修复能力和较快的活性氧清除有关［18］。我们前期研究发现，GDF15 升幅高的BM-MSCs凋亡率较低［13］，提示GDF15可能参与BMMSCs的放射抗性，但具体机制未明。本研究发现放射可诱导BM-MSCs中GDF15表达显著上调，而干扰其表达可导致放射后细胞凋亡率增加，证实GDF15可促进细胞的放射抵抗。细胞对放射的敏感性与所处的周期密切相关，处于G1/S期的细胞放射敏感性低，处于G2期的细胞放射敏感性高［19］。已有文献报道，GDF15参与细胞周期的调控。如在宫颈癌细胞中，GDF15 诱导c-Myc 的表达，c-Myc 作为调节细胞周期的经典转录因子，可诱导CDK1和cyclinB1的上调，CDK1-cyclinB1 形成复合物促进细胞通过G2期［7，20］。本研究也证实干扰GDF15，放射后BMMSCs 的G2期阻滞增加。但是否GDF15通过该机制参与放射后BM-MSCs的G2期调控有待进一步研究。

线粒体是放射损伤的重要靶点。放射可直接作用于线粒体DNA，也可间接通过辐解产生的活性氧损伤线粒体的蛋白及细胞膜系统，破坏电子传递链（ETC）复合物Ⅰ、Ⅱ等，从而导致线粒体膜通透性改变、融合-分裂动态平衡失衡、线粒体膜电位下降等一系列结构和功能损害［21］。此外，GDF15也是线粒体功能损伤的标志物［22］。因此，我们检测了干扰GDF15 对放射前后线粒体膜电位以及Caspase3 剪切情况的影响。正常的线粒体膜电位是维持线粒体功能的关键，而其膜电位的降低是细胞凋亡早期的一个标志性事件［23］。本研究结果显示干扰GDF15对正常BM-MSCs线粒体膜电位无显著影响，但放射后却可以显著降低线粒体膜电位。此外，干扰GDF15 的BM-MSCs 放射后Cleaved caspase3 水平最高。综上所述，干扰GDF15诱导BM-MSCs放射敏感性增加可能与线粒体凋亡途径增强有关。

ERK信号通路在BM-MSCs的增殖、分化和凋亡中具有重要作用。抑制ERK1/2 磷酸化可通过调控Bax 和Bcl-2 表达水平，激活Caspase3，导致细胞凋亡［24］。在多种肿瘤细胞中，已有研究证实GDF15可结合酪氨酸激酶受体ErbB2，激活ErbB2 的激酶活性，进而磷酸化ERK1/2 调控细胞增殖［7，25］。因此，我们检测了在BM-MSCs 中GDF15 对ERK1/2 磷酸化的影响，结果显示干扰GDF15 抑制了ERK1/2的磷酸化水平。ERK1/2 对细胞凋亡的调控主要通过对Bcl-2和Bax蛋白调节实现。研究表明，ERK1/2依赖性磷酸化可以激活cAMP反应性元素结合蛋白（CREB），磷酸化的CREB 入核并与Bcl-2 的启动子结合，从而促进Bcl-2 转录［24］。当Bcl-2 表达较Bax多时，两者可以结合形成异源二聚体，抑制细胞的凋亡，而Bcl-2表达较Bax少时，Bax自身会形成同源二聚体，促进细胞的凋亡［27］。既往研究表明，与放射敏感性细胞相比，MSCs高表达抗凋亡蛋白Bcl-2，低表达促凋亡蛋白Bax［1］。因此，本研究检测了干扰GDF15之后，Bcl-2和Bax在BM-MSCs中的表达。干扰GDF15 后Bcl-2 蛋白水平降低，Bax 蛋白水平升高，表明GDF15对BM-MSCs放射抗性的调控可能通过ERK/Bcl-2通路实现。

综上所述，本研究证明了GDF15作为放射应激分子，通过激活ERK/Bcl-2通路活性，参与BM-MSCs的放射抗性调控，为放射后造血微环境的重建提供了调控靶分子。然而，BM-MSCs细胞中GDF15影响ERK磷酸化的具体机制尚不清楚，有待进一步的研究探索。