五倍子瘢痕膏提取液通过miR-21靶向调控mTOR通路对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡的影响

唐志铭，丁继存，翟晓翔，荆梦晴，王蒙蒙，陆 鹭

瘢痕疙瘩是因皮肤遭受创伤和刺激后真皮网状层出现慢性炎症[1]，从而导致成纤维细胞大量增殖和以胶原为主的细胞外基质过度沉积所致。其确切发生机制尚未阐明，也无理想的治疗方法[2]。本课题组应用五倍子瘢痕膏治疗瘢痕疙瘩临床疗效确切[3]，且前期实验研究证实其能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖[4]，但具体作用机制尚不清楚。有研究者应用基因芯片技术证明miRNA在病理性瘢痕与正常皮肤组织中存在差异性表达[5,6]，其中miR-21在增生性瘢痕组织中表达显著高于正常皮肤组织[7]。有研究表明miR-21可靶向抑制10号染色体张力缺失蛋白磷酸酶（phospatase and tensin homologdeleted on chromasom ten，PTEN）表达[8]，而PTEN是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的负反馈调控因子。mTOR信号通路与细胞异常增殖密切相关，在瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖过程中具有重要作用[9]。五倍子瘢痕膏抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖是否与其通过miR-21靶向调控mTOR通路有关？本课题组对此进行了研究探索。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 兔抗人磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、PTEN、p-mTOR单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗（Jackson免疫研究公司）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（上海索莱宝生物科技有限公司）、双萤光素酶报告基因检测试剂盒（Promega公司）、miR-21 mimic、miR-21 inhibitor（ 广州锐博生物科技有限公司）、反转录试剂 盒 superscript III 、Lipofectamine 2000 转 染 试剂、pmirGLO质粒载体（美国Invitrogen公司）。

1.1.2 主要仪器 聚合酶链反应（PCR）仪（加拿大Funglyn Biotech公司）、电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、Quantity-one凝胶成像分析系统、酶标仪（美国Bio-Rad公司）、红外荧光成像仪（美国Li-Cor公司）、Image Pro-Plus图像分析系统（美国Media Cybernetics公司）、流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司）。

1.1.3 标本来源 标本来自徐州市中医院皮肤科瘢痕疙瘩患者手术切除治疗后的前胸部瘢痕疙瘩组织及邻近正常皮肤组织。所有取材操作均经徐州市中医院伦理委员会批准，且患者或其家属签署知情同意书。患者瘢痕疙瘩均处于增生活跃期，术前1年内未接受任何治疗，并且无系统性疾病，无肿瘤病史。经术后组织病理检查均证实为瘢痕组织，其中男3例，女5例，共8份瘢痕疙瘩组织标本，8份正常皮肤组织标本。

1.2 方法

1.2.1 瘢痕疙瘩成纤维细胞分离、培养 将所切取的瘢痕疙瘩及正常皮肤组织剪成1 mm3大小的组织块，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化14 h后，200目筛网过滤，收集滤液；将滤液离心，1 000 r/min，7 min，弃上清液；用含10%胎牛血清的DMEM液5 ml混匀沉淀细胞，置于1个25 ml的培养瓶中；在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中静置培养48 h后，用含10%胎牛血清的DMEM换液。细胞接近长满时，按1:3比例进行传代。本实验选用第3代细胞。

1.2.2 实验分组 实验分为7组：空白对照组（MOCK）、miR-21 mimic 组（MIM）、0.5 mg/ml五 倍子瘢痕膏提取液 +mimic组（0.5 mg/ml Galla+MIM）、1 mg/ml五倍子瘢痕膏提取液 +mimic组（1 mg/ml Galla+MIM）、miR-21 inhibitor 组（IN）、0.5 mg/ml五倍子瘢痕膏提取液 +inhibitor组（0.5 mg/ml Galla+IN）、1 mg/ml五倍子瘢痕膏提取液+inhibitor组（1mg/ml Galla+IN）。

1.2.3 将第3代成纤维细胞配成单个细胞悬液，以1.0×l04/ml的密度接种于96孔培养板中，每孔200 μl，置于CO2培养箱中常规培养，待细胞生长至融合度为60%～70%时，更换无血清培养基后进行转染，MIM 组、0.5 mg/ml Galla+MIM 组 及 1 mg/ml Galla+MIM 组转染 miR-21 mimic，而 IN 组、0.5 mg/ml Galla+IN 组 及 1 mg/ml Galla+IN 组 转 染 miR-21 inhibitor，MOCK组不转染。转染12 h后吸去培养板孔内旧培养液，再每孔加入DMEM液180 μl，然后各个实验组分别加入相应浓度五倍子瘢痕膏提取液[为五倍子瘢痕膏药物组方（五倍子、蜈蚣、丹参、威灵仙、地骨皮、黑醋、白矾）的提取物]20 μl，MOCK组则加入含10%胎牛血清的DMEM液20 μl，培养24 h后收集细胞提取总RNA，48 h后收集细胞提取蛋白。

1.2.4 逆转录（RT）-PCR检测miR-21、PTEN mRNA的表达 将所切取的瘢痕疙瘩和正常皮肤组织制成组织匀浆后用RT-PCR试剂盒进行总RNA提取。瘢痕疙瘩成纤维细胞按前述方法分离培养及分组干预后，标准环境下孵育24 h，然后采用RT-PCR试剂盒进行总RNA提取。电泳鉴定提取RNA的完整性。取6 μl RNA 为反转录模板。反转录反应体系为 20 μl，反应条件 ：37℃ 1 h，95℃ 3 min。标准曲线定量法制备cDNA模板标准品，依次10倍梯度稀释，制备成5个梯度的cDNA模板定量标准品。内参基因选用ß-肌动蛋白，在GenBank数据库中获得目的基因mRNA序列，采用Primer express2.0软件，在CDS区设计特异性引物。引物序列见表1。

表1 miR-21、PTEN基因引物序列及扩增产物片段长度

PCR反应体系为50 μl，反应条件：93℃预变性3 min，93℃变性 30 s，57℃退火 30 s，共循环 30 次，72℃延伸 5 min。取 6 μl PCR 产物于 1.5% 琼脂糖凝胶中电泳，用Quantity-one凝胶成像分析系统分析各条带的灰度值，以各目的基因与内参基因U6的灰度值比值表示mRNA的相对表达量。

1.2.5 Western Blot检测 PTEN、PI3K、P-Akt、p-mTOR蛋白的表达 收集培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液洗2次，加入细胞裂解液，在冰面上静置 10 ～ 20 min，用细胞刮匀浆后，4℃下 15 000 r/min离心10 min，取上清。用Lowry 法对上清进行蛋白定量，取50 μg蛋白上样到15% 的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。待溴酚蓝进入凝胶底部后，将蛋白质再印迹到硝酸纤维素膜上，加入一抗4℃孵育过夜，最后加入HRP标记的相应二抗，室温孵育1 h，洗膜后，odyssey红外荧光成像仪扫描膜并成像，成像图用Image Pro-Plus图像分析系统测定其灰度值，以ß-肌动蛋白为内参计算蛋白相对表达量。

1.2.6 萤光素酶报告基因检测 应用生物信息学方法预测miR-21与PTEN mRNA 的结合位点，然后合成PTEN-WT 3'UTR和PTEN-MT 3'UTR引物序列，并插入双酶切位点。以人瘢痕成纤维细胞基因组 DNA为模板进行 PCR扩增，获得含miR-21靶序列的3'-UTR基因片段。回收片段，酶切pmirGLO与3'-UTR基因片段连接，构建野生型pmirGLO -PTEN-3'UTR-WT和突变型pmirGLOPTEN-3'UTR-MT重组载体质粒。应用Lipofectamine 2000 转染试剂，将PTEN野生型和突变型质粒分别与 miR-21 mimic、miR-21 inhibitor及阴性对照共转染瘢痕疙瘩成纤维细胞72 h，然后应用萤光素酶检测试剂盒检测萤光素酶活性。

1.2.7 CCK8法检测细胞增殖状况 将瘢痕疙瘩成纤维细胞以1.0×l04/ml密度接种于96孔培养板中，每孔100 μl，每组设8个复孔，在37℃、5%CO2培养箱中过夜，吸去细胞上清液，加入无血清DMEM培养液100 μl静置24 h，使其同步化。吸去培养板孔内旧培养液，按分组加入含相应浓度药品的培养液100 μl，空白对照组则直接加入 DMEM 液 100 μl。继续培养，然后分别于不同时间点（24 h、36 h、48 h），每孔加入 CCK-8 10 μl，37℃继续培养 4 h 后，在酶标仪波长490 nm处测定各孔吸光度（A）值，以A值大小表示细胞增殖能力。

1.2.8 流式细胞仪检测细胞凋亡及周期情况 收集培养48 h后的瘢痕疙瘩成纤维细胞，PBS洗3次，将Annexin V-FITC 5 μL 加入细胞悬液 195 μl中，避光孵育 15 min，加入碘化丙啶（ PI） 5 μl，4℃避光反应5 min，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期各时相DNA水平。

1.3 统计学方法

应用SPSS20.0软件对实验数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，多样本均数间的两两比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖状况

CCK8法检测结果显示，miR-21 mimic能明显促进瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，而五倍子瘢痕膏提取液能减弱这一作用且呈时间、浓度依赖性（图1a）；miR-21 inhibitor能明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，而五倍子瘢痕膏提取液能增强这一作用且呈时间、浓度依赖性（图1b）。

图1 各组瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖状况

2.2 瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡及周期情况

流式细胞仪检测结果显示（n=8），MIM组、0.5 mg/ml Galla+MIM 组 及 1 mg/ml Galla+MIM 组 瘢 痕疙瘩成纤维细胞总凋亡率分别为3.13±0.78、5.10±1.02、8.19±1.26，均低于MOCK组（10.17±1.64），差异具有统计学意义（P＜0.05，图2）；IN组、0.5 mg/ml Galla+IN 组及 1 mg/ml Galla+IN 组瘢痕疙瘩成纤维细胞总凋亡率分别为18.36±2.37、22.50±2.65、29.47±2.86，均高于MOCK组，差异具有统计学意义（P＜0.05，图2）。

细胞周期分析结果显示，与MOCK组[G1期、S 期细胞比例分别为（57.7±5.8）%、（20.5±2.7）%]相比， MIM 组 [（32.8±3.2）%、（21.3±2.9）%]、0.5 mg/ml Galla+MIM 组 [（38.4±3.5）%、（19.5±2.5）%]及 1 mg/ml Galla+MIM 组 [（47.8±4.5）%、（15.6±2.2）%]G1期、S 期细胞比例降低；与MOCK相比，IN 组、0.5 mg/ml Galla+IN 组及 1 mg/ml Galla+IN 组G1期细胞比例 [分别为（67.6±5.8）%、（70.7±6.3）%、（75.5±6.8）%]明显性增加，尤以 1 mg/ml Galla+MIM组增加明显，而S 期细胞比例降低[分别为（12.4±2.4）%、（11.3±2.1）%、（15.8±3.2）%]（图3）。

2.3 双萤光素酶报告基因实验结果

将野生型或突变型PTEN-3'UTR质粒与miR-21 mimic、miR-21 inhibitor或阴性对照（miR-NC）共转染到瘢痕疙瘩成纤维细胞中（n=8），然后检测荧光素酶相对活性。结果显示，共转染野生型pmirGLO-PTEN-3'UTR-WT质粒转染时，miR-21 mimic能降低萤光素酶活性（0.28±0.07），而miR-21 inhibitor能增加萤光素酶活性（1.56±0.17），与阴性对照组（1.00±0.00）相比具有显著性差异（P＜0.05，图4）；而共转染突变型pmirGLO-PTEN-3'UTR-MT质粒，两组萤光素酶活性（1.01±0.03、0.98±0.02）与阴性对照组（1.00±0.00）相比均无明显变化（P＞0.05）。这提示 miR-21可直接结合于 PTEN 3'-UTR，靶控 PTEN的表达。

图4 双萤光素酶报告基因实验结果

2.4 瘢痕疙瘩组织中miR-21、PTEN的表达

RT-PCR检测结果显示（n=8），与正常皮肤组织（0.73±0.04）相比，miR-21在瘢痕疙瘩组织中（1.76±0.13）表达明显增加（P＜0.05，图5a）；Western blot检测结果显示（n=8），与正常皮肤组织（2.13±0.21）相比，瘢痕疙瘩组织中（0.94±0.10）PTEN表达显著降低（P＜0.05，图5b，5c）。Pearson法相关性分析显示，miR-21与PTEN 相对表达量呈负相关（r=-0.772，P＜ 0.05）。

图5 正常皮肤组织和瘢痕疙瘩组织中miR-21及 PTEN表达

2.5 瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-21、PTEN mRNA的表达

RT-PCR检测结果显示（n=8），与MOCK组（1.00±0.00）相比，miR-21mRNA相对表达量在MIM组、0.5 mg/ml Galla+MIM 组及 1 mg/ml Galla+MIM 组（分别为8.13±0.97、6.26±0.86、4.37±0.81）中增加，尤以MIM组表达量增加明显（P＜0.01，图6a），而PTEN mRNA相对表达量（分别为0.29±0.04、0.44±0.06、0.68±0.08）降低，尤以MIM组表达量降低明显（P＜0.05，图6b）。与MOCK组（1.00±0.00）相比，miR-21mRNA相对表达量在IN组、0.5 mg/ml Galla+IN组及1mg/ml Galla+IN组（分别为0.69±0.08、0.45±0.07、0.28±0.04） 中 降 低， 尤 以 1 mg/ml Galla+IN组表达量降低明显（P＜0.05，图6c），而PTEN mRNA相对表达量（分别为8.85±1.04、10.39±1.26、12.99±1.82）增加，尤以 1 mg/ml Galla+IN组表达量增加明显（P＜0.01，图6d）。

图6 各组瘢痕疙瘩成纤维细胞miR-21、PTEN mRNA相对表达量

2.6 瘢痕疙瘩成纤维细胞PI3K、PTEN、p-Akt、p-mTOR蛋白表达

Western Blot检测结果显示（n=8），PI3K 蛋白相对表达量在 MIM 组、0.5 mg/ml Galla+MIM 组及1mg/ml Galla+MIM 组分别为 0.80±0.07、0.87±0.08、0.88±0.11，与MOCK组（1.00±0.00）相比无明显差异（P＞ 0.05），在 IN 组、0.5 mg/ml Galla+IN 组及 1 mg/ml Galla+IN 组分别为 1.02±0.17、0.95±0.15、0.95±0.14，与MOCK组（1.00±0.00）相比亦无明显差异（P＞0.05，图7a）。

图7 各组瘢痕疙瘩成纤维细胞PI3K、PTEN、p-Akt、p-mTOR蛋白表达

与MOCK相比（1.00±0.00），MIM组、0.5 mg/ml Galla+MIM 组 及 1 mg/ml Galla+MIM 组 PTEN 蛋白相对表达量（分别为0.53±0.04、0.74±0.06、0.83±0.08）降低，尤以MIM组降低明显（P＜0.05，图 7b）；与 MOCK 相比（1.00±0.00）， MIM 组、0.5 mg/ml Galla+MIM组p-Akt蛋白相对表达量（分别为1.54±0.17、1.44±0.16）及p-mTOR蛋白相对表达量（分别为1.38±0.18、1.27±0.21）增加，而1 mg/ml Galla+MIM 组 p-Akt、p-mTOR 蛋白相对表达量（分别为0.87±0.08、0.78±0.09）降低（P＜0.05，图 7c，7d）。

与 MOCK 相 比，IN 组、0.5 mg/ml Galla+IN 组及1 mg/ml Galla+IN组PTEN蛋白相对表达量（分别为1.53±0.18、2.07±0.31、2.23±0.36）增加，尤以 1 mg/ml Galla+MIM组增加明显（P＜0.05，图7e）；而p-Akt蛋白相对表达量（分别为0.83±0.07、0.69±0.05、0.36±0.03）及p-mTOR蛋白相对表达量（分别为0.63±0.06、0.52±0.05、0.46±0.02）降低，尤以 1 mg/ml Galla+MIM组降低明显（P＜0.05，图7f，7g）。

3 讨论

中医学认为瘢痕疙瘩属“肉龟疮”、“肉蜈蚣”、“蟹足肿”等范畴，其基本病机为“湿毒搏结，气血瘀滞”，即机体素有湿浊内蕴，复有金刀、火毒和虫毒外袭，伤及肌肤，致营卫不和，湿毒搏结，日久则经络痹阻，气血瘀滞而成[10]。五倍子瘢痕膏是已故中医皮肤科大家欧阳恒教授在这一病机理论指导下，以化瘀软坚解毒法为组方原则创制而成（具体方药为黑醋、五倍子、蜈蚣、丹参、威灵仙、地骨皮、白矾）。本课题组前期临床研究表明五倍子瘢痕膏治疗瘢痕疙瘩疗效确切[3]。此外，前期实验研究显示五倍子瘢痕膏能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖[4]及胶原合成[11]，但具体作用机制尚不清楚。

有研究表明，miRNAs在瘢痕疙瘩瘢痕形成过程中起着重要作用[12]，其在病理性瘢痕与正常皮肤组织中存在着差异性表达[5,6]，其中miR-21在增生性瘢痕组织中表达显著高于正常皮肤组织[7]。这提示miR-21与瘢痕疙瘩的发生有密切的关系。有研究证实miR-21可靶向抑制PTEN表达促进肺癌细胞增殖侵袭[8],而PTEN是具有磷酸酶活性的抑癌基因[13]，也是mTOR信号通路的一个重要负反馈调控因子。mTOR信号通路是调控蛋白质合成的主要信号通路，与细胞增殖、分化密切相关。mTOR信号通路包括PI3K、PTEN、Akt、mTOR等关键分子，其中PTEN是负反馈调节因子。研究证实，mTOR基因与细胞异常增殖及肿瘤的发生密切相关，在多种肿瘤组织中表达明显增强[14,15]。瘢痕疙瘩属于良性实体瘤，可向周围正常组织呈侵袭性生长，其组织病理特点与肿瘤极为相似，具有类肿瘤特性。因此，笔者推测在瘢痕疙瘩形成过程中mTOR信号通路具有重要的作用，且miR-21对该信号通路存在调控作用，而五倍子瘢痕膏抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖可能与其通过miR-21靶向调控mTOR通路有关。

为证实以上科研假设，本课题组应用双萤光素酶报告基因验证了miR-21可直接结合于 PTEN 3'-UTR而靶向调控 PTEN的表达。RT-PCR及Western Blot检测结果显示，瘢痕疙瘩组织中miR-21高表达而PTEN低表达。CCK8法、流式细胞仪、RT-PCR、Western Blot等检测结果显示，转染 miR-21 mimic 后瘢痕疙瘩成纤维细胞miR-21表达增加、PTEN表达降低及p-Akt、p-mTOR表达增加，且能明显促进瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖并抑制其凋亡，而五倍子瘢痕膏提取液能减弱这一作用且呈浓度依赖性。转染miR-21 inhibitor后瘢痕疙瘩成纤维细胞miR-21表达降低、PTEN表达增加及p-Akt、p-mTOR表达降低，且能明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖并促进其凋亡，而五倍子瘢痕膏提取液能增强这一作用且呈浓度依赖性。

以上研究结果表明，miR-21 可通过靶基因PTEN调控瘢痕疙瘩成纤维细胞mTOR信号通路关键分子p-Akt、p-mTOR的表达。而五倍子瘢痕膏抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的机制与其抑制miR-21表达进而上调mTOR信号通路中PTEN表达，从而抑制p-Akt、p-mTOR表达有关，这为五倍子瘢痕膏治疗瘢痕疙瘩提供了理论依据。