Sirt1在银屑病皮损中的表达及对连接蛋白表达的影响

吴军阳，李维鑫

Sirt1（silent information regulator protein1）是体内一种非常重要的组蛋白和非组蛋白去乙酰化酶，参与蛋白质的去乙酰化调控过程。目前研究发现，Sirt1参与了基因沉默、机体长寿、生物周期节律、能量代谢、新陈代谢以及应激的调控等，在糖尿病、心血管疾病、慢性炎症性肺部疾病、慢性肾脏疾病、神经变性以及肿瘤等疾病的治疗和预防中发挥重要的作用。近年来研究发现，Sirt1与皮肤疾病亦存在密切的关系[1]。本研究旨在探讨Sirt1对银屑病紧密连接蛋白和黏着连接蛋白表达的影响，探讨其可能的临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本采集 病例组：银屑病皮损组织标本来自昆山市第一人民医院皮肤科经临床及组织病理确诊的20例寻常性银屑病患者。对照组：正常对照组皮肤组织标本来自18例经临床检查排除银屑病及其他常见皮肤病的整形外科手术患者的正常皮肤组织。细胞培养：人永生化角质形成细胞株（HaCaT细胞）（南京凯基生物科技发展有限公司）。

1.1.2 主要仪器和试剂 免疫组化DAB试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司），兔抗人Sirt1抗体（北京博奥森生物技术有限公司），兔抗人紧密连接蛋白（ZO-1、occludin）抗体（美国Proteintech Group公司），兔抗人黏着连接蛋白（E-cadherin）抗体（美国Bioworld公司），兔抗人GAPDH抗体（美国Bioworld公司），山羊抗兔抗体（美国BIO-RAD公司），FluorChem FC2凝胶成像仪（美国 Alpha Innotech公司），琼脂糖凝胶成象分析仪（美国BIO-RAD公司），酶标仪（美国BioTek公司），培养板（美国Corning公司），DMEM培养基（上海英骏生物技术有限公司），胎牛血清（北京赛默飞生物化学制品有限公司），白藜芦醇（美国Sigma公司），烟酰胺（美国Sigma公司），总RNA提取试剂盒（北京百泰克生物科技有限公司），cDNA合成试剂盒（北京百泰克生物科技有限公司），显影液BeyoEcl plus（碧云天生物技术研究所），聚合酶链反应（PCR）引物为南京金斯瑞生物技术有限公司合成。人Sirt1引物序列：正向引物5'-GCGATTGGGTACCGAGATAAC-3'，反向引物5'-GGCCTTGGAGTCCAGTCACTA-3'，GAPDH引物序列：正向引物5'-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3'，反向引物 5'-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3'。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化检测银屑病皮损组织中Sirt1、ZO-1、occludin、E-cadherin的表达水平 取本院病理科已制备的银屑病及正常对照组的皮肤组织石蜡切片，按免疫组化DAB试剂盒步骤操作：二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，柠檬酸盐溶液微波炉高温抗原修复，行内源性过氧化物酶封闭，正常羊血清孵育，兔抗人一抗室温孵育2 h，羊抗兔二抗孵育1 h，HPP标记的链霉亲和素孵育，DAB染色，梯度乙醇脱水，二甲苯溶液透明， 中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。以PBS一抗作空白对照，DAB染色后用苏木素复染。棕褐色染色为阳性结果。

1.2.2 细胞培养及实验分组 HaCaT细胞于含10%胎牛血清、100 U/ml青、链霉素的高糖DMEM培养基中培养。白藜芦醇和烟酰胺浓度分别配置为100 mmol/L和1 mol/L。实验分为3组：阴性对照组，白藜芦醇组（Res组），烟酰胺组（Nic组）。

1.2.3 各组细胞RNA、蛋白质收集 HaCaT细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养，取处于对数生长期的细胞，以3×108/L的密度接种到6孔培养板中，每孔3 ml。细胞生长至80%融合时，换同量的无血清DMEM培养基继续培养。6 h后，Res组加入浓度为 100 mmol/L 的白藜芦醇 3 μl，Nic组加入浓度为1 mol/L的烟酰胺3 μl，对照组不作任何处理。继续培养24 h后，根据总RNA提取试剂盒的步骤提取RNA，检测浓度，并根据cDNA合成试剂盒步骤反转录成cDNA，-20℃保存备用。相同方法处理各组细胞，继续培养24 h后，加入裂解液，高速离心取上清，获得蛋白，酶标仪检测各组蛋白浓度，-20℃保存备用。

1.2.4 HaCaT细胞Sirt1基因（mRNA）表达测定 反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Sirt1的基因表达水平，以GAPDH作为内参，将保存的cDNA以Sirt1、GAPDH正反向引物和扩增混合物于PCR仪中扩增为DNA。PCR的条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环30次，最后72℃延伸2 min。以5 μl PCR的产物加1 μl 6×上样缓冲液上样，设置1%琼脂糖凝胶电泳100 V 30 min，然后琼脂糖凝胶成像分析仪拍照。采用ImageJ软件检测各组吸光度，比较mRNA表达量。

1.2.5 HaCaT细胞Sirt1、ZO-1、occludin、E-cadherin蛋白表达测定 蛋白质印迹试验（Western blotting）检测Sirt1、ZO-1、occludin、E-cadherin蛋白表达水平。以GAPDH作为内参，各组蛋白以每孔30 μg上样行聚丙烯酰胺凝胶电泳，25 V半干式转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，置一抗（以封闭液1:1 000稀释）中，4℃孵育过夜，TBST洗3×10 min，置生物素标记的羊抗兔二抗（以封闭液1:3 000稀释）中室温孵育2 h，TBST 洗 3×10 min，显影液 BeyoEcl plus 外敷于FluorChem FC2凝胶成像仪曝光拍照。使用ImageJ软件检测吸光度，比较各组蛋白表达量。

1.3 统计学方法

实验重复3次后，采用SPSS17.0统计学软件进行统计学分析，采用方差分析法比较Res组、Nic组与对照组间有无统计学差异。

2 结果

2.1 Sirt1在银屑病皮损组织中的表达与分布

在正常人皮肤组织中，Sirt1在表皮各层细胞均显著高表达，而在银屑病患者皮损中Sirt1各层表达量均有下降，且在颗粒层下降较明显（图1）。

图1 Sirt1在正常人皮肤及银屑病患者皮损中的表达与分布（SP法 ×100）

2.2 ZO-1、occludin、E-cadherin在银屑病皮损中的表达与分布

与正常人皮肤组织相比，银屑病患者皮损组织中紧密连接蛋白ZO-1、occludin和黏着连接蛋白E-cadherin表达量显著升高，在表皮各层均显著高表达（图2）。

图2 3种连接蛋白在正常人皮肤与银屑病患者皮损中的表达与分布（SP法×100）

2.3 Sirt1在角质形成细胞中的表达与调控

分别使用Sirt1的特异性激活剂白藜芦醇和抑制剂烟酰胺处理HaCaT细胞后，与对照组相比，激活剂Res组Sirt1表达水平均明显增加（P＜0.05），而抑制剂Nic组Sirt1表达差异无统计学意义（P＞0.05）（图3，图4）。

图3 3组HaCaT细胞Sirt1基因（mRNA）表达水平

图4 3组HaCaT细胞的Sirt1蛋白表达水平

2.4 Sirt1表达对角质形成细胞间连接蛋白的影响

激活剂白藜芦醇和抑制剂烟酰胺处理细胞后，与对照组相比，Res组紧密连接蛋白ZO-1和occludin表达水平显著下降（P＜0.05），而Nic组差异无统计学意义。黏着连接蛋白E-cadherin在Res组表达水平明显下降（P＜0.05），而Nic组表达差异无统计学意义（图5）。

图5 3组HaCaT细胞各连接蛋白表达水平

3 讨论

银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，病程较长且易复发，其病因和发病机制至今未完全清楚，可能与感染、遗传、免疫功能异常、内分泌异常等因素有关[2]。近年来研究发现，银屑病患者存在不同程度的皮肤屏障功能损伤，保湿修复皮肤屏障功能已成为治疗银屑病的重要辅助治疗方法[3]。银屑病皮损角质形成细胞中，角蛋白及细胞间脂质均异常表达[4]。研究表明，银屑病患者存在构成细胞间紧密连接和黏着连接的连接蛋白表达和分布异常，与正常表皮相比，紧密连接蛋白（如ZO-1、occludin、Cldn-4）其表达范围明显增大，除颗粒层外，在棘层等其他层均较高表达[5]。

紧密连接蛋白和黏着连接蛋白是构成角质形成细胞间连接的重要组成部分，参与维持皮肤的屏障功能。紧密连接蛋白和黏着连接蛋白的调控主要受基因和外部环境因素影响，其中环境因素诱导的组蛋白乙酰化和去乙酰化反应是一种重要的表观遗传调节方式，可以通过调控特定基因表达水平来影响皮肤连接蛋白的表达。Sirt1是体内一种非常重要的组蛋白和非组蛋白去乙酰化酶，参与蛋白翻译后的去乙酰化修饰过程。在这过程中，Sirt1在细胞染色质水平，通过诱导组蛋白去乙酰化来调控包括染色质重组、转录活化或抑制、细胞周期、细胞分化及细胞凋亡等一系列生物学效应，特别是与细胞活化后的基因转录表达调控有关。Sirt1属于Ⅲ型去乙酰化酶，其发挥去乙酰化效应必须依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的作用。Sirt1被NAD+激活后，使组蛋白和非组蛋白的赖氨酸残基脱去乙酰基，产生O-乙酰基-ADP核糖和烟酰胺，从而产生一系列的调节效应[6]。Sirt1主要通过与P53、NF-κB、FOXO、MEF2、MyoD、PPAR-γ、PGC-1α、eNOS 等转录因子结合，发挥去乙酰化效应而产生机体长寿、能量代谢、炎症、应激以及肿瘤的调控等作用。

目前已有研究表明，Sirt1与银屑病存在密切的联系。研究发现，在银屑病皮损组织中Sirt1水平明显下降[7,8]；Sirt1激活剂SRT2014对银屑病患者取得了良好的组织学改善[9]。尽管目前对银屑病的Sirt1及连接蛋白均有研究，然而银屑病皮损中Sirt1与皮肤紧密连接蛋白和黏着连接蛋白是否有相关性还不是很清楚，尚未检索到相关文献报道。本实验论证了Sirt1与连接蛋白的直接关系，实验中以Sirt1及文献中常使用的紧密连接蛋白ZO-1、occludin，黏着连接蛋白E-cadherin作为检测指标，首先采用免疫组化技术检测Sirt1、ZO-1、occludin、E-cadherin在银屑病同一皮损中的表达与分布情况，推测其之间的相关性。结果发现，与人正常皮肤组织相比，Sirt1在银屑病患者皮损组织中表达水平下降，而紧密连接蛋白ZO-1、occludin，黏着连接蛋白E-cadherin表达均显著增高。紧密连接蛋白ZO-1、occludin、黏着连接蛋白E-cadherin表达增高可能与Sirt1表达水平下降有关。为了进一步证实Sirt1与连接蛋白表达的相关性，本实验选用Sirt1的特异性激活剂白藜芦醇和抑制剂烟酰胺对HaCaT细胞进行研究。白藜芦醇是Sirt1的特异性激活剂，其特异性、敏感性较强，具有抗炎、抗增殖、抗氧化及缓解皮肤光老化等功能[10]。而烟酰胺是Sirt1的抑制剂，其为Sirt1的产物，可通过负反馈作用抑制Sirt1的活性。研究结果显示，白藜芦醇可激活Sirt1的表达，且在Sirt1作用下，HaCaT细胞的紧密连接蛋白ZO-1、occludin及黏着连接蛋白E-cadherin表达均显著下降。而烟酰胺不能明显抑制Sirt1的表达，对紧密连接蛋白和黏着连接蛋白无效应或作用较弱，其可能与烟酰胺的抑制效应有关，烟酰胺主要通过负反馈效应来发挥抑制Sirt1的作用，其抑制效应不显著。

在银屑病皮损组织中，连接蛋白ZO-1、occludin、E-cadherin表达范围及表达量异常增多，Sirt1 对其的下调作用有希望成为银屑病治疗的靶点。Sirt1如何作用于连接蛋白，其具体的信号通路等还需要作进一步研究。