实时荧光定量多聚酶链反应扩增技术联合浓缩涂片染色法快速诊断结核病的效果

李 乔，吴 健，陈泽城

（高州市人民医院检验科，广东 高州 525200）

防治结核病是全球面临的公共卫生问题。大量的研究表明，尽早地对结核病患者的病情进行诊治是控制其病情发展的关键[1-3]。目前，临床上常采用直接涂片染色法、改良罗氏培养法、MGIT-960 培养法等对结核病患者的病情进行诊断。本文主要是探讨用Real-time PCR 扩增技术联合浓缩涂片染色法快速诊断结核病的效果。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本文的研究对象是2016 年6 月至2020 年6 月期间高州市人民医院检验科收到的526 份分泌物标本。在这526份分泌物标本中，痰液标本有427 份，支气管冲洗液标本有37 份，尿液标本有25 份，胸腹液标本有25 份，脓液标本有5 份，脑脊液标本有2 份，心包液标本有2 份，组织标本有2 份，精液标本有1 份。

1.2 方法

采用直接涂片染色法进行病原体检测的方法是：按照《痰涂片镜检质量保证手册》的要求，将分泌物标本均匀地涂抹在载玻片上，并进行抗酸染色操作[4]。染色完毕后，将载玻片放置于显微镜下进行检查。采用Real-time PCR 扩增技术联合浓缩涂片染色法进行病原体检测的方法是：将5 ～10 mL 的分泌物标本放置在50 mL 离心管中。按照《结核病细菌学检验规程》及BACTEC MAGIT-960 操作规程进行碱消化浓缩操作[5]。在沉渣中加入0.7 ～1 mL 的PBS缓冲液（pH=6.8），制成混合液。对该混合液进行离心处理，制成离心沉渣悬浮液。将0.1 mL 的离心沉渣悬浮液加入到DNA 提取管中，将0.5 mL 的离心沉渣悬浮液加入到BACTEC MGIT-960 培养管中，取0.1 mL 离心沉渣悬浮液制成规格为10 mm×10 mm 的载玻片，然后，按照结核分歧杆菌核酸扩增荧光检测试剂说明书的要求，将DNA 提取管、BACTEC MGIT-960 培养管及载玻片分别放置在达安760 实时荧光定量PCR 仪（生产企业为中山大学达安公司）中。按照中国防痨协会制定的《结核病细菌学检验规程》，对阳性菌株进行菌种鉴定[6]。根据《痰涂片镜检质量保证手册》的要求，对采用直接涂片染色法、浓缩涂片染色法进行病原体检测的结果进行判定。按照结核分歧杆菌核酸扩增荧光检测试剂说明书的要求，对采用Real-time PCR技术联合浓缩涂片染色法进行病原体检测的结果进行判定。根据BACTEC MGIT-960 全自动分歧杆菌培养系统出具的阳性报告，对阳性菌株进行菌种鉴定。

1.3 观察指标

观察采用BACTEC MGIT-960 培养法、直接涂片染色法、Real-time PCR 扩增技术联合浓缩涂片染色法对这526份分泌物标本进行病原体检测的时间、结核分枝杆菌的检出率及用Real-time PCR 扩增技术联合浓缩涂片染色法诊断结核病的灵敏度、特异度及准确率。敏感度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%。特异度=真阴性例数/（真阴性例数+ 假阳性例数）×100%。准确率=（真阳性例数+真阴性例数）/（真阳性例数+真阴性例数+假阳性例数+假阴性例数）×100%。

1.4 统计学处理

对本次研究中的数据均采用SPSS 21.0 统计软件进行处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用t检验，计数资料用百分比（%）表示，采用χ²检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 采用不同的方法对526 份分泌物标本进行病原体检测的情况

与采用直接涂片染色法相比，采用MGIT-960 培养法、Real-time PCR 扩增技术联合浓缩涂片染色法对526 份分泌物标本进行病原体检测时结核分枝杆菌的检出率更高，P＜0.05。与采用MGIT-960 培养法相比，采用直接涂片染色法、Realtime PCR 扩增技术联合浓缩涂片染色法对526 份分泌物标本进行病原体检测的时间更短，P＜0.05。详见表1。

表1 采用不同的方法对526 份分泌物标本进行病原体检测的情况

2.2 采用Real-timePCR 扩增技术联合浓缩涂片染色法诊断结核病的灵敏度、特异度及准确率

采用Real-time PCR 扩增技术联合浓缩涂片染色法对526 份分泌物标本进行病原体检测的结果显示，真阳性患者有140 例，真阴性患者349 有例，假阳性患者有21 例，假阴性患者有16 例。采用Real-time PCR 扩增技术联合浓缩涂片染色法诊断结核病的灵敏度、特异度、准确率分别为89.7%、94.3%、93.0%。详见表2。

表2 采用Real-time PCR 扩增技术联合浓缩涂片染色法诊断结核病的灵敏度、特异度及准确率（%）

3 讨论

目前，临床上常采用直接涂片染色法、BACTEC MGIT-960 培养法等对结核病患者的分泌物标本进行病原体检测。采用直接涂片染色法对结核病患者的分泌物标本进行病原体检测具有简便快捷、检查费用低的特点。但用此法对结核病患者病情进行诊断的敏感度、特异度均较低。在临床上，采用BACTEC MGIT-960 培养法进行病原体检测的结果是诊断结核病的金标准。有研究表明，采用BACTEC MGIT-960 培养法对结核病患者病情进行诊断的效率较低，患者需要等待1 ～2 个月才能够得到检查的结果[7]。近年来，分子生物学技术被广泛地应用于结核病的快速诊断中[8]。Real-time PCR 扩增技术基于TaqMan 荧光探针原理，可通过检测荧光信号的强弱计算PCR 产物的数量。浓缩涂片染色法具有可直接观察到抗酸杆菌的特点。陈昕昶等[9]的研究表明，采用Real-time PCR 扩增技术联合浓缩涂片染色法对结核病患者的分泌物标本进行病原体检测，既可简化检验的流程，又可大大地缩短进行检测的时间。

综上所述，用Real-time PCR 扩增技术联合浓缩涂片染色法可快速对结核病患者的病情进行诊断，且准确率较高。