环状RNA circ-COPA在胃癌组织中表达的临床意义及其对胃癌细胞生物学行为的影响

吴 菁，蒋志勇，李奎生，刘 芳，吕志武，黄明沂，肖 瑶

（1. 深圳市宝安区福永人民医院消化内科，广东 深圳 518103 ；2. 武汉大学中南医院影像科，湖北 武汉 430071 ；3. 南方医科大学附属深圳宝安医院消化内科，广东 深圳 518101）

胃癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，具有易转移、易复发的特点[1]。此病患者的预后通常较差，近年来其病死率呈逐年上升的趋势[2]。寻找有效的胃癌分子标志物及治疗靶点是临床上研究的热点。环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类呈闭环结构的小分子非编码RNA。此类RNA 可通过多种方式调节靶基因的转录及翻译，从而可在细胞中发挥重要的生物学作用[3]。有研究显示，circRNA 在结直肠癌组织、肺癌组织等多种癌组织中呈异常表达，并会参与调控肿瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡、衰老等过程[4]。circ-COPA 是一种新明确的circRNA，由5044 个碱基组成，其在胃癌组织中的表达情况及参与胃癌发生的机制尚不清楚。本文主要是分析circ-COPA 在胃癌组织中表达的临床意义及其对胃癌细胞增殖、侵袭及阿片样物质结合蛋白/细胞黏附分子样蛋白（opioid binding protein/cell adhesion molecule-like，OPCML）表达的影响。

1 材料与方法

1.1 组织标本

选取2017 年12 月至2021 年3 月期间在我院接受手术治疗和病理检查的52 例胃癌患者作为研究对象。将这些患者的癌组织标本及癌旁组织标本（距肿瘤边缘＞5 cm）均置于液氮罐中保存。这些患者术前均未接受过放疗或化疗，且均知情并同意参与本研究。

1.2 细胞株与主要试剂

胃癌SGC7901 细胞购于中国科学院上海生科院细胞资源中心；对照序列和circ-COPA 序列购于广州锐博生物技术公司；胎牛血清、杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM）购于美国Gibco 公司；引物购自武汉擎科生物技术公司；Lipofectamine 3000 转染试剂和Matrigel 基质胶购于美国Invitrogen 公司；Transwell小室购于美国Beaver 公司；逆转录试剂盒、定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-PCR，qRTPCR）试剂盒购于日本TaKaRa 公司；细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）购于武汉碧云天生物科技有限公司；一抗甘油醛-3- 磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、OPCML 购于美国Affinity 公司；辣根过氧化物酶标记的二抗购于武汉博士德生物科技公司。

1.3 检测52 例患者癌组织及癌旁组织中circ-COPA 和OPCMLmRNA 的表达量

采用qRT-PCR 技术检测这些患者癌组织及癌旁组织中circ-COPA 和OPCML mRNA 的表达量。采用TRIzol 法提取组织和细胞中的总RNA，使用紫外分光光度计检测RNA 质量，将RNA 逆转录成cDNA，并根据qRT-PCR 试剂盒说明书进行扩增处理。circ-COPA 正向引物序列为5’-GCAGGCATTTCGGATCCATAA-3’，反向引物序列为5’-TCGGAGCAGAGATCACACTAT-3’；GAPDH 上游引物序列为5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物序列为5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；OPCML上游引物序列为5’-TACCATAGATGACCGGGTAACC-3’，下游引物序列为5’-CGTTTTGGGATGATTGTCTGTCT-3’。以GAPDH 作为内参，采用2-ΔΔCt法计算定量结果。

1.4 SGC7901 细胞的培养和转染

对冻存于液氮罐中的SGC7901 细胞进行复苏处理后，将其置于含10% 胎牛血清的DMEM 中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下进行培养。取对数生长期的SGC7901 细胞接种于24 孔板中，将其分为Control 组和circ-COPA 组。为Control 组细胞和circ-COPA 组细胞分别转染对照序列、circ-COPA 序列（根据转染试剂说明书进行转染）。24 h 后，采用qRT-PCR 技术检测两组细胞中circ-COPA 的表达量。

1.5 采用CCK-8 法检测两组细胞的增殖能力

将两组细胞均匀种植于96 孔板中，每孔加100 μL 细胞悬液（将细胞密度调整为6×103个/mL）。在培养箱中分别培养1 d、2 d、3 d、4 d、5 d 后，加入10 μL 的CCK-8试剂。在培养箱中孵育3 h，于波长490 nm 处使用酶标仪检测并记录每孔的吸光度。

1.6 采用Transwell 小室实验检测两组细胞的侵袭能力

采用Matrigel 基质胶包被Transwell 上室。取两组细胞（使用无血清培养基将细胞密度调整为6×104 个/mL）各100 μL，分别加入Transwell 小室上层。在小室下层分别加入含10% 胎牛血清的DMEM 500 μL，然后将其置于培养箱中培养48 h。取出小室，使用棉签擦去膜上细胞，用4%的多聚甲醛溶液固定30 min。置于0.1% 的结晶紫染料中染色30 min，用流水洗涤并晾干，在显微镜下拍照、计数。

1.7 采用Westernblot 技术检测两组细胞中OPCML 的表达量

将两组细胞分别加入到适量的放射免疫沉淀法（radio immuno precipitation assay，RIPA）裂解液中裂解，并提取总蛋白。采用十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出蛋白，用聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜对其进行转膜，并用脱脂牛奶对其实施封闭。加入一抗OPCML（浓度为1:1000）、GAPDH（浓度为1:1000），在4℃下孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗（浓度为1:10 000），在室温下孵育3 h。使用ECL 发光试剂盒进行显色、拍照，用Quantity One 软件检测OPCML 条带灰度值（以GAPDH 蛋白为内参）。

1.8 统计学处理

对本研究中的所有数据均采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析，计量资料用均数± 标准差（±s）表示，采用t检验，计数资料用百分比（%）表示，采用χ²检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 52 例患者癌组织及癌旁组织中circ-COPA 的表达量

进行qRT-PCR 检测的结果显示，52 例患者癌组织及癌旁组织中circ-COPA 的表达量分别为（1.89±0.48）和（6.02±0.45）。与癌旁组织相比，52 例患者癌组织中circ-COPA 的表达量较低，t=36.24，P＜0.01。详见图1。

图1 52 例患者癌组织及癌旁组织中circ-COPA 的表达量（注：** 与癌旁组织相比，P ＜0.01）

2.2 52 例患者癌组织中circ-COPA 的表达量与其临床病理特征的关系

以52 例患者癌组织中circ-COPA 表达量的中位数1.51为界值，患者癌组织中circ-COPA 的表达量≥1.51 表示其存在癌组织中circ-COPA 高表达的情况，患者癌组织中circ-COPA 的表达量＜1.51 表示其存在癌组织中circ-COPA 低表达的情况。在52 例患者中，年龄≥60 岁患者与年龄＜60 岁患者中存在癌组织中circ-COPA 低表达情况患者的占比相比，P＞0.05 ；男性患者与女性患者中存在癌组织中circ-COPA 低表达情况患者的占比相比，P＞0.05 ；与病灶直径＜5 cm 的患者相比，病灶直径≥5 cm 患者中存在癌组织中circ-COPA 低表达情况患者的占比较高，P＜0.05 ；与肿瘤TNM 分期为Ⅰ期或Ⅱ期的患者相比，肿瘤TNM 分期为Ⅲ期患者中存在癌组织中circ-COPA 低表达情况患者的占比较高，P＜0.05 ；与未发生淋巴结转移的患者相比，发生淋巴结转移患者中存在癌组织中circ-COPA低表达情况患者的占比较高，P＜0.05。详见表1。

表1 52 例患者癌组织中circ-COPA 的表达量与其临床病理特征的关系[例(%)]

2.3 两组细胞中circ-COPA 的表达量

进行qRT-PCR 检测的结果显示，Control 组细胞和circ-COPA 组细胞中circ-COPA 的表达量分别为（1.17±0.39） 和（10.79±1.28）。circ-COPA 组 细 胞 中circ-COPA 的表达量是Control 组细胞的9.22 倍，组间差异有统计学意义（t=7.18，P＜0.01）。

2.4 两组细胞增殖能力的比较

在培养2 d、3 d、4 d、5 d 后，circ-COPA 组细胞的吸光度均低于Control 组细胞，P＜0.05。详见表2。

表2 两组细胞培养后不同时间吸光度的比较（± s ）

表2 两组细胞培养后不同时间吸光度的比较（± s ）

组别 培养1 d 后 培养2 d 后 培养3 d 后 培养4 d 后 培养5 d 后Control 组（n=5） 0.37 ± 0.02 0.73 ± 0.06 1.11 ± 0.07 1.31 ± 0.04 1.46 ± 0.04 circ-COPA 组（n=5） 0.36 ± 0.05 0.53 ± 0.07 0.82 ± 0.06 0.93 ± 0.05 1.05 ± 0.06 t 值 0.90 2.91 3.76 5.60 6.05 P 值 0.42 0.04 0.03 0.00 0.00

2.5 两组细胞侵袭能力的比较

进行Transwell 小室实验的结果显示，Control 组细胞和circ-COPA 组细胞的侵袭数分别为（48.29±4.93）个和（18.88±3.75）个；与Control 组细胞相比，circ-COPA 组细胞的侵袭数较低，t=4.75，P＜0.01。详见图2。

图2 两组细胞侵袭数的比较（注：** 与Control 组相比，P ＜0.01）

2.6 两组细胞中OPCMLmRNA 表达量的比较

进行qRT-PCR 检测的结果显示，Control 组细胞和circ-COPA 组细胞中OPCML mRNA 的表达量分别为（1.09±0.26）和（5.62±0.61)，组间差异有统计学意义（t=6.89，P＜0.01）。

2.7 两组细胞中OPCML 表达量的比较

进行Western blot 检测的结果显示，Control 组细胞和circ-COPA 组细胞中OPCML 的表达量分别为（1.19±0.21）和（5.22±0.88）， 组 间 差 异 有 统 计 学 意 义（t=4.46，P＜0.01）。详见图3。

图3 两组细胞中OPCML表达量的比较

3 讨论

有研究指出，circRNA 在胃癌组织和癌旁组织中的表达水平存在较大差异，其表达水平可能与胃癌的发生、发展密切相关[5]。相关的研究显示，跨膜蛋白87A（transmembrane protein 87A，TMEM87A）、circ_0032821等circRNA 在胃癌组织中表达水平的变化情况与胃癌的发生密切相关[6-8]。本研究的结果显示，与癌旁组织相比，52例患者癌组织中circ-COPA 的表达量较低，P＜0.05。在52 例患者中，年龄≥60 岁患者与年龄＜60 岁患者中存在癌组织中circ-COPA 低表达情况患者的占比相比，P＞0.05；男性患者与女性患者中存在癌组织中circ-COPA 低表达情况患者的占比相比，P＞0.05 ；与病灶直径＜5 cm 的患者相比，病灶直径≥5 cm 患者中存在癌组织中circ-COPA低表达情况患者的占比较高，P＜0.05 ；与肿瘤TNM 分期为Ⅰ期或Ⅱ期的患者相比，肿瘤TNM 分期为Ⅲ期患者中存在癌组织中circ-COPA 低表达情况患者的占比较高，P＜0.05 ；与未发生淋巴结转移的患者相比，发生淋巴结转移患者中存在癌组织中circ-COPA 低表达情况患者的占比较高，P＜0.05。这表明，胃癌患者癌组织中circ-COPA 的表达水平与其肿瘤的TNM 分期、病灶直径及淋巴结转移的情况有关，circ-COPA 在诊断胃癌及判断胃癌患者预后方面的应用价值较高。本研究的结果显示，在培养2 d、3 d、4 d、5 d 后，circ-COPA 组细胞的吸光度均低于Control 组细胞，P＜0.05。进行Transwell 小室实验的结果显示，与Control 组细胞相比，circ-COPA 组细胞的侵袭数较低，P＜0.05。这表明，上调胃癌SGC7901 细胞中circ-COPA 的表达水平能够抑制其增殖和侵袭能力。有研究指出，circRNA 可通过增强靶基因mRNA 的稳定性来调控肿瘤细胞的生物学行为[9]。相关的研究表明，circ-COPA 的可能靶基因为OPCML 基因。OPCML 基因位于染色体11q25，基因长度为600 kb，由7 个外显子组成[10]。OPCML 属于免疫球蛋白超家族，可参与调控细胞的识别和黏附，在细胞分化、发育方面发挥着重要的作用[11]。有研究指出，胃癌患者癌组织中OPCML 的表达水平与其肿瘤分期和分级有显著的相关性，上调其OPCML 的表达水平可抑制其体内癌细胞的增殖和侵袭[12]。本研究的结果显示，Control 组细胞和circ-COPA 组细胞中OPCML mRNA 的表达量分别为（1.09±0.26）和（5.62±0.61)，组间差异有统计学意义（t=6.89，P＜0.01）。Control 组细胞和circ-COPA 组细胞中OPCML 的表达量分别为（1.19±0.21）和（5.22±0.88），组间差异有统计学意义（t=4.46，P＜0.01）。这表明，上调胃癌SGC7901 细胞中circ-COPA 的表达水平能够促进OPCML mRNA 和OPCML 的表达。有研究指出，circ-COPA 能够增强OPCML mRNA 的稳定性，其对胃癌细胞增殖和侵袭的影响可能与其能够促进OPCML 基因表达有关。

综上所述，与癌旁组织相比，胃癌组织中circ-COPA的表达水平较低。上调胃癌SGC7901 细胞中circ-COPA的表达水平能够抑制其增殖和侵袭能力。circ-COPA 对胃癌SGC7901 细胞增殖和侵袭能力的影响可能与其能够促进OPCML 基因的表达有关。