固相萃取净化HPLC法同时检测荔枝皮中的几种原花青素

覃国新，李慧玲，何洁，周其峰，劳水兵，闫飞燕，王静，金茂俊，程亮，韦宇宁，王海军，陈泳锨

（1.广西壮族自治区农业科学院农产品质量安全与检测技术研究所，农业部甘蔗品质监督检验测试中心（南宁），广西南宁 530007）（2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业部农产品质量安全重点实验室，北京 100081）

荔枝属于无患子科常绿植物所结的果实，是我国亚热带特色水果之一，其工业化生产中主要以鲜果、罐头、干果和干制品为主，荔枝皮作为其副产品并没有得到合理有效的开发及利用，而通常将其当做废弃物丢弃，因此，以荔枝皮为原料提取原花青素，属于废物资源再利用。荔枝皮富含有原花青素[13-15]，其含量测定方法主要有铁盐催化比色法、香草醛法、紫外分光光度法等[16,17]。然而，以上方法测定的是原花青素单体及其多聚体的总量，且受干扰性较强，重复性较差，样品前处理操作较繁琐。采用固相萃取净化以简化繁琐的样品前处理应用于色谱分析已相关文献报道[18]；高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法具有选择性好、分离效率高、测定相对准确等特点，已有文献报道用HPLC测定原花青素的主要单体和低聚物含量[19-21]，目前未见采用固相萃取净化HPLC法同时测定荔枝皮原花青素中儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4和原花青素A2的相关报道，因此，本实验采用采用固相萃取净化HPLC法，对荔枝皮中原花青素主要单体和重要低聚物的含量进行了研究，该方法简便，快速，准确，可为深入挖掘我国丰富的荔枝资源副产品的开发和利用提供理论依据。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

荔枝皮市售荔枝（品种妃子笑）。

儿茶素对照品（纯度98.5%）、表儿茶素对照品（纯度98.8%）、没食子酸对照品（纯度95.9%）、原花青素B2对照品（纯度98.9%）、原花青素B4对照品（纯度95.0%）、原花青素A2对照品（纯度96.5%），上海诗丹德标准技术服务有限公司；甲醇、乙醇、冰乙酸（均为色谱纯试剂），赛默飞世尔（中国）科技有限公司；水为自制蒸馏水；其余试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

Waters 2695高效液相色谱仪配置二级管阵列检测器，美国waters公司；色谱柱Thermo Syncronis C18（250×4.6 mm，5 μm）；0.22 μm有机相微孔滤膜，美国waters公司；DS-1型高速组织捣碎机，上海标模仪器厂；Oasis PRiME HLB固相萃取柱（3 cc，150 mg，2 mL，部件号186008717，使用前无需活化），沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱为Thermo Syncronis C18（250×4.6 mm，5 μm）；柱温35 ℃，流速1.0 mL/min，进样量5.0 μL。流动相A：甲醇；流动相B：1.0%冰乙酸溶液。梯度洗脱程序为：0～2.0 min，10%～15% A；2.0～8.5 min，

15%～30% A；8.5～12.0 min，30%～85% A；12.0～14.0 min，85%～10% A；14.0～16.0 min，10% A。

1.3.2 对照品溶液的制备

public MyEventArgs(string oldState,string newState)

分别精密称取儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2对照品，置于10 mL棕色容量瓶中，用色谱纯甲醇溶解定容，摇匀，配制成质量浓度为1000 mg/L的对照品储备液，于冰箱中冷藏保存备用。

1.3.3 样品溶液的制备

采集新鲜荔枝，取其果皮，经组织掏碎机掏碎，混匀，真空包装得到荔枝皮原料，置于0～4 ℃冰箱中备用。准确称取上述制备好的荔枝皮原料5.0 g于100 mL塑料离心管中，加入50 mL 85%乙醇水溶液，放入30 ℃超声波清洗仪中超声提取30 min，然后，4000 r/min离心5 min，上层提取液转移至圆底烧瓶中，将残渣重复上述操作提取，合并2次提取液，在旋转蒸发仪中蒸至近干，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，供Oasis PRiME HLB固相萃取柱净化。

将Oasis PRiME HLB固相萃取柱（无需活化）安装到预先清洁过的锥形瓶上，取2 mL上述溶液通过Oasis PRiME HLB柱并收集全部滤液，得到样品溶液，过0.22 μm有机微孔滤膜，供HPLC测定。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

实验考察了甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂提取待测物中的原花青素，并通过HPLC法对不同提取溶剂所得提取液中原花青素A2含量的测定来比较提取效果。按照料液比为1:20加入浓度为85%（V/V）的甲醇、乙醇和丙酮水溶液，按照1.3.3的方法进行提取，按1.3.1条件进行HPLC分析。实验结果发现，3种溶剂的提取效果相差较小，但由于甲醇和丙酮的毒性均比乙醇高，鉴于质量安全考虑，本实验选择乙醇作为最佳提取溶剂。且按照1.3.1色谱条件分析，所得色谱图如图1和图2所示，图1和图2分别为标准品与荔枝皮基质加标的液相色谱图，从图中可以看出儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2能达到很好的分离效果。

图1 儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2对照品（10.0 mg/L）的色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of catechin, epicatechin, gallic acid, procyanidin B2, procyanidinB4, procyanidin A2 standard(10.0 mg/L)

图2 荔枝皮基质加标（加标水平10.0 mg/kg）色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of litchi pericarp spiked at 10.0 mg/kg level

2.2 方法线性关系、检测限和定量限

分别准确移取6种对照品储备液，用甲醇配制成浓度为100 mg/L的标准中间混合溶液；并用甲醇逐级稀释标准中间混合溶液，配制得到0.5、1、5、10、50和100 mg/L系列的标准工作液。按1.3.1项色谱条件进行HPLC测定。以峰面积（Y）与对照品质量浓度（X，mg/L）进行线性回归，绘制标准曲线。结果儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2的线性方程见表1，相关系数均大于0.9998，6种化合物在0.5～100.0 mg/L范围内具有良好的线性关系。如图1和图2所示，以3倍信噪比所对应待测物浓度来确定化合物的检出限（LOD），以10

表1 儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4和原花青素A2的线性方程、相关系数Table 1 Linear equations and correlation coefficients for the determination of catechin, epicatechin, gallic acid, procyanidin B2, procyanidin B4 and procyanidin A2

倍信噪比所对应的待测物浓度确定化合物的定量限（LOQ），本方法儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2的样品检出限分别为0.52、0.55、0.35、0.45、0.95和0.65 mg/kg，定量限分别为1.26、1.64、0.95、1.35、2.80和1.45 mg/kg。

2.3 精密度实验

取同一浓度（10 mg/L）对照品工作液，按5.0 μL进样量，在HPLC上连续进样6次，按1.3.1节色谱条件进行测定，儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2峰面积的RSD分别为0.45%、0.35%、0.62%、0.55%、0.95%和0.75%，结果表明，本研究测定方法的精密度良好。

2.4 稳定性实验

取同一加标的供试品溶液，分别于0、2、4、8、12 h进样，按1.3.1节色谱条件进行测定，测定儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2峰面积的RSD分别为0.86%、0.75%、0.64%、0.78%、0.98%和0.69%，这表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.5 重复性实验

取1.3.3制备好的荔枝皮原料6份，每份10.0 g，按1.3.3节方法提取样品溶液，按1.3.1节色谱条件重复测定，求得儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2的RSD值分别为1.02%、0.97%、1.24%、1.18%、1.28%和1.31%。结果表明，本研究的方法重复性良好。

2.6 回收率实验

精密称取6份荔枝皮原料，每份5.0 g，分别加入混合标准溶液，按1.3.3节方法制备样品溶液，按1.3.1节色谱条件进行测定，结果见表2。计算得到儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4、原花青素A2的平均回收率在83.00%～102.00%之间，RSD在0.48%～0.83%之间。说明本研究建立的儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4和原花青素A2测定方法准确度高。

表2 6种化合物在荔枝皮基质中的平均回收率及RSDTable 2 Average recoveries and precision of the 6 compounds spiked into litchi pericarp matrices (n=6)

2.7 实际样品测定

从本地农贸市场随机购买10份荔枝（品种妃子笑），按1.3.3节方法提取样品溶液，按1.3.1节色谱条件进行含量测定，分别测出儿茶素、表儿茶素、没食子酸、和原花青素A2，且4种物质的含量范围分别为5.01～5.60、7.52～8.90、2.05～3.51、10.73～12.53 mg/kg，这一结果反映了荔枝皮原花青素主要单体和低聚物中以表儿茶素和原花青素A2的含量相对较高，这与文献[13]报道相一致。结果显示，荔枝皮中的原花青素主要以儿茶素、表儿茶素和原花青素A2的含量最高，这为我国丰富的荔枝资源副产品的开发和利用提供理论依据。

3 结论

本文首次建立了固相萃取净化/高效液相色谱法同时测定荔枝皮中儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4和原花青素A2的分析方法，本方法采用新型固相萃取技术，操作简单快捷，样品净化液经HPLC分离，外标法定量，结果准确可靠，可用于同时测定荔枝皮中儿茶素、表儿茶素、没食子酸、原花青素B2、原花青素B4和原花青素A2检测分析。