二维斑点追踪成像评价红景天苷对脓毒症大鼠心功能的保护作用

王 臻，秦文娟，翟子敬,冯 佳，黄 磊，董珊珊，芦桂林*

(1.石河子大学医学院临床学院，新疆 石河子 832008；2.石河子大学医学院第一附属医院超声医学科，新疆 石河子 832008)

脓毒症是严重威胁生命的全身性感染疾病，可合并器官功能障碍，约80%严重脓毒症患者存在心肌抑制，且40%心肌抑制可发展为心肌损伤[1]。红景天苷萃取于植物红景天，具有抗炎、抗肿瘤和神经保护功能等多种作用[2]，可改善冠状动脉血流，保护心肌，抑制心室重构，抗心律失常及减轻再灌注损伤等[3]。左心室射血分数(left ventricular ejection fraction， LVEF)为评价心功能的主要指标，但无法全面反映心肌分层及节段相关运动情况。建立在二维斑点追踪成像(two-dimensional speckle tracking imaging， 2D-STI)基础上的分层应变技术可获得左心室三层心肌及各节段心肌峰值应变，精确评估各层心肌功能[4]。本研究采用2D-STI技术评价红景天苷对脓毒症大鼠心脏及心肌的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 红景天苷(北京索莱宝科技有限公司，纯度99%)，脂多糖(Sigma)，心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ， cTnⅠ)试剂盒、脑钠肽(brain natriuretic peptide， BNP)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 实验动物及分组 将32只12周龄无特定病原体(specific pathogen free， SPF)级SD雄性大鼠[石河子大学医学院第一附属医院动物实验中心提供，许可证：SCXK(新)2011-0004]随机均分为对照组、脓毒症组、低剂量组及高剂量组，分笼喂养，室温18～26℃，相对湿度40%～70%，光照明暗周期12 h，自由采食与饮水。

1.3 模型制备 适应性饲养1周后，对照组、脓毒症组以15 mg/kg体质量生理盐水灌胃7天，低、高剂量组红景天苷(15 mg/kg、30 mg/kg体质量)连续灌胃7天，均为每日1次。于末次灌胃后1 h予脓毒症组、低、高剂量组10 mg/kg体质量脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)，对照组以等体质量生理盐水腹腔注射[5]。观察大鼠一般情况。

1.4 心脏超声参数测量 于腹腔注射后12 h以10%水合氯醛(3.5 ml/kg体质量)腹腔注射麻醉大鼠，左侧卧位保定于检查台，固定四肢及门齿，连接小动物心电图。由1名具有5年以上工作经验的超声科医师采用GE Vivid E9彩色多普勒超声诊断仪，12S心脏探头，频率12 MHz，于胸骨旁长轴切面测量左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter， LVEDD)、室间隔舒张末期厚度(interventricular septal thickness at end-diastole， IVSD)、左心室后壁舒张末期厚度(left ventricular posterior wall thickness at end diastole， LVPWD)、左心室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening， LVFS)及LVEF。采集左心室短轴乳头肌水平动态图(>10个心动周期)并导入EchoPAC工作站，手动勾画ROI，记录左心室心内膜下层心肌(global circumferential strain in subendocardial myocardium， GCS-Endo)、中层心肌(global circumferential strain in middle myocardium， GCS-Mid)及心外膜下层心肌(global circumferential strain in subepicardial myocardium， GCS-Epi)圆周应变，分析各节段(前壁、侧壁、后壁、下壁、前间隔及后间隔)圆周应变率(circumferential strain rate， SrC)。以上参数均测量3次，以平均值的绝对值作为结果。

1.5 心肌指标 于下腔静脉采血3 ml，-80℃保存。按照cTnⅠ及BNP试剂盒相关说明进行操作。所有检测均重复3次，取平均值作为结果。

1.6 病理学 采血后处死大鼠，摘取心脏后冲洗、甲醛固定，常规行HE染色，封片后于光镜下观察心肌形态学变化。

1.7 统计学分析 采用SPSS 22.0统计分析软件。以±s表示服从正态分布的计量资料，采用单因素方差分析比较组间超声参数及心肌指标差异。以Spearman相关分析评价2D-STI参数与cTnⅠ、BNP的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 对照组大鼠反应灵敏，采食、饮水正常。脓毒症组大鼠背毛竖起、皮温降低、呼吸短促，活动减少，精神状态差，对刺激反应减弱，不采食，伴腹泻等。低剂量组大鼠背毛蓬松，活动减少，采食量减少，刺激反应稍弱，少量稀水样便。高剂量组大鼠采食饮水，行动缓慢，反应略迟缓，一般情况尚可。

2.2 超声心动图参数 脓毒症组、低、高剂量组LVFS、LVEF均明显低于对照组(P均<0.05)。低剂量组LVEF明显高于脓毒症组(P<0.05)；高剂量组LVFS、LVEF均明显高于脓毒症组及低剂量组(P均<0.05)；其余参数组间差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠常规超声心动图参数比较(±s，n=8)

表1 各组大鼠常规超声心动图参数比较(±s，n=8)

组别LVEDD(mm)IVSD(mm)LVPWD(mm)LVFS(%)LVEF(%)对照组4.82±0.201.57±0.111.79±0.1149.33±1.1183.78±1.52脓毒症组4.81±0.161.57±0.101.79±0.1435.55±1.58∗65.52±3.11∗低剂量组4.85±0.161.59±0.081.77±0.1338.15±1.42∗69.53±5.28∗#高剂量组4.83±0.151.57±0.111.78±0.1442.40±3.67∗#▲73.91±5.41∗#▲F值0.090.070.0560.0628.48P值0.960.970.98<0.01<0.01

注：*：与对照组比较P<0.05；#：与脓毒症组比较P<0.05；▲：与低剂量组比较P<0.05

2.3 2D-STI参数 各组GCS-Endo及GCS-Mid差异均有统计学意义(P均<0.05)。脓毒症组及低剂量组GCS-Endo、GCS-Mid均明显低于对照组(P均<0.05)；低、高剂量组GCS-Endo、GCS-Mid均明显高于脓毒症组(P均<0.05)；高剂量组GCS-Endo、GCS-Mid均明显高于低剂量组(P均<0.05)。仅对照组与脓毒症组间GCS-Epi差异有统计学意义(P<0.05)，见图1及表2。

图1 大鼠左心室各层心肌应变图 A.对照组； B.脓毒症组； C.低剂量组； D.高剂量组

表2 各组大鼠左心室分层整体圆周应变比较(±s，n=8)

表2 各组大鼠左心室分层整体圆周应变比较(±s，n=8)

组别GCS-Endo(%)GCS-Mid(%)GCS-Epi(%)对照组24.13±2.2314.22±1.778.00±3.23脓毒症组11.68±1.80∗6.68±2.00∗5.48±1.69∗低剂量组19.27±1.92∗#10.10±1.54∗#6.48±1.25高剂量组23.01±1.61#▲12.86±1.20#▲6.92±2.15F值69.6832.171.77P值<0.01<0.010.17

注：*：与对照组比较P<0.05；#：与脓毒症组比较P<0.05；▲：与低剂量组比较P<0.05

各组左心室各节段SrC差异均具有统计学意义(P均<0.05)。脓毒症组左心室各节段SrC均低于对照组(P均<0.05)；低、高剂量组除前壁外各节段SrC均低于对照组(P均<0.05)；低剂量组前壁及后壁SrC高于脓毒症组(P均<0.05)；高剂量组除前间隔外其余节段SrC均高于脓毒症组(P均<0.05)；侧壁、后壁、下壁及后间隔SrC均高于低剂量组(P均<0.05)，见表3及图2。

图2 大鼠左心室各节段心肌应变图 A.对照组； B.脓毒症组； C.低剂量组； D.高剂量组

表3 各组大鼠左心室各节段SrC比较(±s，n=8)

表3 各组大鼠左心室各节段SrC比较(±s，n=8)

组别前壁(%)侧壁(%)后壁(%)下壁(%)前间隔(%)后间隔(%)对照组4.80±1.245.15±0.976.76±0.868.52±0.876.99±1.557.31±0.53脓毒症组2.92±0.71∗3.19±0.61∗2.72±0.39∗2.24±0.59∗3.13±1.19∗4.26±0.65∗低剂量组3.99±0.54#3.45±0.52∗3.33±0.48∗#2.85±0.77∗4.20±0.83∗3.84±0.81∗高剂量组4.33±0.50#4.29±0.59∗#▲5.95±0.31∗#▲5.54±0.69∗#▲4.21±1.03∗5.42±0.87∗#▲F值7.8412.8599.73119.2515.6135.81P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

注：*：与对照组比较P<0.05；#：与脓毒症组比较P<0.05；▲：与低剂量组比较P<0.05

2.4 心肌指标 对照组cTnⅠ、BNP均明显低于其他3组(P均<0.05)；低、高剂量组cTnⅠ、BNP均明显低于脓毒症组(P均<0.05)；高剂量组cTnⅠ、BNP明显低于低剂量组(P<0.05)，见表4。

表4 各组大鼠心肌酶水平比较(±s，n=8)

表4 各组大鼠心肌酶水平比较(±s，n=8)

组别cTnⅠ(pg/ml)BNP(pg/ml)对照组320.75±33.16143.08±30.01脓毒症组889.80±42.10∗846.63±50.70∗低剂量组756.15±36.87∗#759.46±31.60∗#高剂量组655.97±35.69∗#▲709.43±28.11∗#▲F值343.02620.63P值<0.01<0.01

注：*：与对照组比较P<0.05；#：与脓毒症组比较P<0.05；▲：与低剂量组比较P<0.05

2.5 相关性分析 GCS-Endo、GCS-Mid、GCS-Epi与cTnⅠ均呈负相关(r=-0.875、-0.862、-0.407，P均<0.05)；GCS-Endo、GCS-Mid、GCS-Epi与BNP均呈负相关(r=-0.819、-0.845、-0.486，P均<0.05)。GCS-Endo与cTnⅠ间相关性最强。

2.6 病理学 光镜下见对照组心肌细胞排列整齐，大小一致，核清晰可见，形态结构正常(图3)；脓毒症组心肌细胞排列紊乱，肿胀明显，间质充血水肿严重，血管充血扩张，心肌横纹模糊，以心内膜下心肌最为严重(图4)；低剂量组心肌改变较脓毒症组减轻，心肌细胞肿胀并排列欠规整，出现少量空泡样改变，红细胞渗出较多；高剂量组心肌细胞排列基本整齐，染色较均匀，细胞肿胀不明显，红细胞渗出较少，心肌横纹尚清晰。

图3 对照组大鼠心肌病理图 A.心肌(HE，×4)； B～D.分别为心内膜下、中层、心外膜下心肌(HE，×100)

图4 脓毒症组大鼠心肌病理图 A.心肌(HE，×4)； B～D.分别为心内膜下、中层、心外膜下心肌(HE，×100)

3 讨论

发生脓毒症时，革兰阴性细菌细胞壁中的LPS可通过细胞膜和细胞内促进炎症因子级联释放，对线粒体功能造成影响，并激活细胞内信号传导，抑制心肌运动[6]。本研究建模后大鼠行动迟缓，对刺激反应性减弱，采食、水次数减少，出现腹泻，背毛竖起等表现，其LVFS、LVEF降低，血清cTnⅠ、BNP明显上升；光镜下见大量红细胞渗出，心肌细胞肿胀且出现空泡样改变，提示建模成功。

本研究脓毒症组左心室各层心肌整体圆周应变及各节段SrC均低于对照组；低、高剂量组各参数均不同程度升高，提示脓毒症对心肌整体及各节段收缩期圆周运动均造成障碍，而红景天苷对心肌具有保护作用，并能减轻损伤。多数健康人的圆周应变以心内膜中最高，其次为心肌和心外膜；收缩变形从心内膜向心外膜存在梯度变化，有助于早期发现心肌变化[7]。心内膜作为冠状动脉终末血管的供血区域较早受脓毒症影响。本研究脓毒症组前间隔SrC与低、高剂量组差异均无统计学意义，可能原因在于脓毒症对左心室前间隔心肌的损伤较为严重，无法缓解，且脓毒症早期心内膜下心肌细胞病理变化引起心肌纤维弹性下降，心肌运动出现异常[8]，即GCS-Endo及节段SrC下降；病理所见证实以心内膜受累最为严重。

cTnⅠ、BNP可预测脓毒症严重程度，并与早期心肌功能障碍和死亡率存在相关性[9]。本研究中GCS-Endo与cTnⅠ的相关性较高(r=-0.875，P<0.05)，提示2D-STI分层应变分析可早期反映心脏功能变化[10]。

病理学观察显示低、高剂量组心肌细胞炎性浸润及细胞肿胀均较脓毒症组有所减轻，表明红景天苷具有抗炎作用，与PU等[11]的结果相符。红景天苷仅使少数患者心率加快[11]，或可长期使用。

综上所述，2D-STI技术可用于评价红景天苷对脓毒症大鼠心肌的保护作用；GCS-Endo是较为敏感的监测指标。本研究的主要局限性：对啮齿类动物尽管可获取四腔心尖的视图，但较少见左心室侧壁，纵向图像质量较差，无法提供相关数据。