APP下载

杨木酶水解液培养枯草芽孢杆菌试验

2021-07-27游佳欣应文俊杨倩倩廖红徐勇张军华

林业工程学报 2021年4期
关键词:杨木鱼粉氮源

游佳欣,应文俊,杨倩倩,廖红,徐勇,张军华,2*

(1. 南京林业大学化学工程学院,南京 210037; 2. 西北农林科技大学林学院,陕西 杨凌 712100)

杨树是我国三大速生人工林树种之一,常用于制浆造纸、家具、建材等。在杨木加工过程中,会产生约40%的杨木废渣,将其制备成生物乙醇[1-2]或高值化学品[3]符合我国绿色经济的理念。益生菌是指对宿主的生理功能产生有益作用的活性微生物,常用于食品、医药和畜牧领域[4-5]。枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌,具有生长速度快、营养需求简单、无毒无害、抗逆性强等优点,其作为国家允许使用的饲料添加剂,在畜牧养殖业中被广泛应用。枯草芽孢杆菌能够分泌纤维素酶、蛋白酶等多种酶、抗菌素等活性物质,提高饲料转化率,促进消化,增强动物免疫力。如在生长肥育猪日粮添加0.03%(质量分数)的枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌以及地衣芽孢杆菌,可提高肥育猪的采食量和消化率[6]。

笔者以杨木酶水解液为原料,采用单因素试验和响应面试验优化了枯草芽孢杆菌的培养基组成和培养条件,绘制了杨木酶水解液培养枯草芽孢杆菌的生长曲线,探讨了枯草芽孢杆菌代谢不同单糖的规律和菌体生长的规律。本研究以杨木纤维素酶水解液作为碳源发酵制备益生菌,为杨木废弃物的高值化利用提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 杨木酶水解液

杨木酶水解液由南京林业大学生物工程系生物化工研究所制得。以杨木屑为原料,经乙酸预处理制备低聚木糖后,利用过氧化氢-乙酸预处理脱除木质素,再经纤维素酶水解得到。杨木酶水解液的化学组成为101.7 g/L葡萄糖、20.7 g/L木糖、8.6 g/L纤维二糖、3.6 g/L乙酸、0.7 g/L乙酰丙酸和0.4 g/L的5-羟甲基糠醛。

1.1.2 枯草芽孢杆菌

BacillussubtilisYS01,由南京林业大学生物工程系生物化工研究所保藏。

1.1.3 纤维素酶

纤维素酶CTec2购自诺维信(中国)生物技术有限公司,酶活为123 FPU/mL,酶蛋白含量为176.2 mg/mL。

1.1.4 主要设备

MAXQ4000型恒温摇床(美国赛默飞)、MLS-3020型高压灭菌锅(日本三洋)、1.6R型冷冻离心机(美国赛默飞)、MSC1.2型无菌操作台(美国赛默飞)、752S型紫外可见光分光光度计(上海棱光技术有限公司)、FE20型pH计(瑞士梅特勒-托利多)、PL303型电子天平(瑞士梅特勒-托利多)、Agi-lent 1260型高效液相色谱仪(德国安捷伦)。

1.1.5 培养基

枯草芽孢杆菌活化培养基:1.0%(质量分数)葡萄糖,1.0%(质量分数)鱼粉蛋白胨,0.5%(质量分数)酵母膏,1.0%(质量分数)NaCl,pH为7.0。

琼脂固体培养基(用于平板计数法计算枯草芽孢杆菌活菌数):0.50%(质量分数)鱼粉蛋白胨,0.25%(质量分数)酵母膏,0.10%(质量分数)葡萄糖,1.50%(质量分数)琼脂,pH为7.0。

初始发酵培养基:1.00%(体积分数)杨木酶水解液,1.00%(质量分数)鱼粉蛋白胨,0.15%(质量分数)K2HPO4,0.02%(质量分数)MgSO4,pH为7.0。

1.2 试验方法

1.2.1 技术路线

杨木屑经乙酸预处理[6.5%(体积分数)乙酸,172 ℃,27 min] 制备低聚木糖后,水洗至中性,自然风干后,得到固体残渣。以此固形物为原料,采用75%(体积分数)的过氧化氢-乙酸(体积比为1∶1)预处理(80 ℃,2 h)[7],将预处理残渣进一步酶水解后得到杨木酶水解液,酶水解液中含有丰富的单糖(葡萄糖和木糖),将作为后续发酵生产枯草芽孢杆菌的碳源。

1.2.2 种子液的制备

吸取保藏于-18 ℃的甘油管中的菌液100 μL,接种于活化培养基中,于37 ℃、150 r/min条件下培养24 h后,作为种子液备用。

1.2.3 OD600值、活菌数的测定和生长曲线的绘制

OD600值、活菌数的测定和生长曲线的绘制方法参考Fan等[8]的方法。

1.2.4 糖含量的检测

葡萄糖和木糖质量浓度的测定采用高效液相色谱法。测试样品先经过10 000 r/min离心5 min,先稀释相应倍数,上清液经0.22 μm的滤膜过滤后,在Agilent 1260型高效液相色谱仪上,色谱柱为Bio-Rad HPX-87H(300 mm×7.8 mm,长×内径),Bio-Rad MG Cartridges(30 mm×4.6 mm,长×内径),流动相为0.005 mol/L硫酸,流速为0.6 mL/min,柱温为55 ℃,在示差折光检测器(RI)上进行检测。

1.2.5 单因素优化培养基组分

按照初始发酵培养基组分进行单因素优化试验,培养基中碳源固定为杨木酶水解液,分别研究氮源(硫酸铵、脲、牛肉膏、酵母浸膏、鱼粉蛋白胨)、无机盐(NaCl、KCl、Na2SO4、K2SO4、Na2HPO4、K2HPO4)、微量元素(MnSO4、MgSO4、ZnCl2、CaCl2)对枯草芽孢杆菌生长情况的影响。确定最适氮源、无机盐和微量元素后,分别研究杨木酶水解液添加量(0%~5.00%)、氮源添加量(0%~5.00%,质量分数)、无机盐添加量(0.010%~0.125%,质量分数)和微量元素添加量(0%~0.05%,质量分数)对枯草芽孢杆菌生长的影响。

根据试验设计配制发酵培养基,灭菌后接种,置于37 ℃、150 r/min条件下发酵培养24 h,每组试验设置3个平行,测定其OD600值和活菌数,分析比较后得到最佳培养基组分。

1.2.6 单因素优化培养条件

按照单因素优化的培养基组分配制发酵培养基,分别考察温度(30,35,40,45和50 ℃)、pH(4.0,5.0,6.0,7.0,8.0和9.0)、摇床转速(110,130,150,170,190和210 r/min)、接种量(0.5%,1.0%,2.0%,5.0%和10.0%体积分数)和装液量(5,10,15,20和25 mL,相对于50 mL体系)对枯草芽孢杆菌生长的影响,每组试验设置3个平行,测定其OD600值和活菌数,分析比较后得到最佳培养条件。

1.2.7 培养基组分的响应面优化

根据单因素优化后的培养基组成,选取杨木酶水解液添加量(2.00%~4.00%体积分数)、鱼粉蛋白胨添加量(1.00%~3.00%质量分数)、K2HPO4添加量(0.03%~0.07%质量分数)3因素3水平,根据软件Design-Expert 12设计的试验方案,每组试验设置3个平行,按照优化后的培养条件进行响应面优化培养24 h后记录结果,并对优化出的结果进行5次重复,利用软件Design-Expert 12进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 培养基单因素优化

2.1.1 杨木酶水解液添加量对枯草芽孢杆菌生长的影响

以杨木酶水解液为碳源时,其添加量对枯草芽孢杆菌生长情况的影响如图1a所示。当培养基中不添加酶水解液时,培养基中的活菌数仅有1.86×108CFU/mL,随着酶水解液的添加量增加至3.00%(质量分数),活菌数明显增加,说明菌体生长情况最好;随着培养基中酶水解液添加量从3.00%增加至5.00%,活菌数并没有随之增加,反而出现缓慢下降趋势。因此选择3.00%为培养基中最佳杨木酶水解液添加量。

图1 碳源和氮源对枯草芽孢杆菌生长情况的影响

2.1.2 氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响

氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响如图1b所示,相比添加无机氮源,有机氮源富含蛋白质等营养物质,更适合枯草芽孢杆菌的培养,鱼粉蛋白胨作为氮源时,枯草芽孢杆菌生长情况最佳,因此选择鱼粉蛋白胨作为枯草芽孢杆菌培养基中的唯一氮源。此外,研究氮源添加量对枯草芽孢杆菌生长情况的影响,结果如图1c所示。当培养基中不添加氮源时,培养基中的活菌数仅有8.23×107CFU/mL。当鱼粉蛋白胨添加量由2.00%增加至5.00%,菌液中活菌数反而减少,说明鱼粉蛋白胨添加过多反而不利于菌体的生长代谢。当鱼粉蛋白胨添加量为2.00%时,枯草芽孢杆菌生长情况最好,活菌数可达到3.62×108CFU/mL,因此选择2.00% 添加量为最适鱼粉蛋白胨添加量。

2.1.3 无机盐对枯草芽孢杆菌生长的影响

在微生物发酵过程中,无机盐不仅可以维持培养基pH稳定,而且提供了菌体核酸合成代谢所必需的元素[9],是培养基重要组分之一。无机盐对枯草芽孢杆菌生长的影响如图2a所示。分别添加Na2HPO4和K2HPO4的枯草芽孢杆菌生长情况明显优于添加NaCl和KCl的培养基生长情况,其原因可能是Na2HPO4和K2HPO4不仅能提供枯草芽孢杆菌生长所需的Na、K元素。而且Na2HPO4和K2HPO4还能提供菌体生长所需的P元素,而且氨基酸前体的活化及一些与代谢有关的酶的合成都与P元素有关。由于添加Na2HPO4和K2HPO4对枯草芽孢杆菌生长情况影响差异不大,菌体生长情况均达到较高水平,因此仅选择K2HPO4作为培养基无机盐组分进行后续试验研究。研究了K2HPO4添加量对枯草芽孢杆菌生长情况的影响,结果如图2b所示。当K2HPO4的添加量增加到0.05%,培养24 h后活菌数最高可达3.68×108CFU/mL。因此,确定K2HPO4最优添加量为0.05%。

2.1.4 微量元素对枯草芽孢杆菌生长的影响

不同微量元素对枯草芽孢杆菌生长的影响如图2c所示,CaCl2和MgSO4的添加均对枯草芽孢杆菌的生长有促进作用。而Mg2+在细胞中糖酵解和三羧酸循环等酶促反应中作为辅助因子,是许多酶催化反应的激活剂,选择合适的Mg2+添加量有助于菌体生长[10]。但在培养基中添加过多的金属离子会对细胞产生毒害作用[11]。因此,选择MgSO4作为枯草芽孢杆菌培养基中的微量元素。MgSO4添加量对枯草芽孢杆菌的增殖效果影响不显著,当添加量为0.04% 时,枯草芽孢杆菌生长量达到最高。因此,选择培养基中MgSO4的添加量为0.04%。

图2 无机盐和微量元素对枯草芽孢杆菌生长情况的影响

经过单因素试验优化后的培养基组成为3.00%(体积分数)杨木酶水解液、2.00%(质量分数)鱼粉蛋白胨、0.05%(质量分数)K2HPO4、0.04%(质量分数)MgSO4,该培养基组成将用于后续培养条件的单因素优化试验。

2.2 培养条件的单因素试验

温度主要影响菌体中酶反应速率,温度适当升高,加快菌体中酶促反应速率,增强菌体代谢,但温度过高将不利于菌体生长,结果如图3a所示。随着温度由30 ℃升高至50 ℃,枯草芽孢杆菌活菌数先增加后降低,其中在35 ℃条件下生长情况最佳,活菌数可达到3.62×108CFU/mL。培养温度超过35 ℃后,枯草芽孢杆菌生长能力逐渐降低。因此,选择35 ℃为枯草芽孢杆菌最佳培养温度。

pH对枯草芽孢杆菌生长的影响由图3b所示,枯草芽孢杆菌在酸性和碱性环境下均具有一定耐受性[12],当pH为4.0或9.0时,枯草芽孢杆菌仍能生长,但此种情况下并不利于其生长。根据枯草芽孢杆菌在不同pH条件下的生长情况可以看出,菌体在pH为7.0时生长情况最佳。

摇床转速的改变对枯草芽孢杆菌生长情况的影响主要是影响通气量,从而影响培养基中的溶氧。随着摇床转速增加至190 r/min,枯草芽孢杆菌生长情况达到最佳(图3c),活菌数可达到3.62×108CFU/mL,因此选择最佳摇床转速为190 r/min。

装液量对枯草芽孢杆菌生长的影响如图3d所示,适当调整装液量有益于枯草芽孢杆菌的生长,50 mL三角瓶的5 mL体系中,活菌数达到最高值6.88×108CFU/mL,装液量为10 mL时,生长情况次之,活菌数可达6.05×108CFU/mL。结合实际情况和培养效率,选择装液量为10 mL为最适装液量。

图3 培养条件对枯草芽孢杆菌生长情况的影响

接种量对枯草芽孢杆菌的增殖效果影响不显著。当接种量为2.0%(体积分数)时,菌液中活菌数可达到最高,因此选择的接种量为2.0%。综上,根据培养条件的单因素优化试验结果,确定枯草芽孢杆菌的最佳培养条件为:温度35 ℃、pH 7.0、转速190 r/min、接种量2.0%、装液量为10 mL(相对于50 mL)。

2.3 响应面优化培养基组分试验的分析

通过单因素试验确定了影响枯草芽孢杆菌生长的3个主要因素(杨木酶水解液、鱼粉蛋白胨、K2HPO4),采用Box-Behnken的中心组合设计原理设计3因素3水平的响应面分析试验(表1),以最终确定最佳发酵培养基组分。对表1中结果进行分析,得到回归模型ANOVA分析和各因素的主效应结果(图4),根据表1可得出模型的p值小于0.000 1,说明该模型显著,而误差项p值大于0.05,说明失拟项不显著,未知因素对试验结果干扰小。拟合检验显著,说明建立的模型是有效的,与实际情况拟合较好,并且3种因素对枯草芽孢杆菌生长的影响是显著的。

表1 响应面法对菌液OD600的ANOVA分析

两因素交互作用影响枯草芽孢杆菌生长的响应面分析由图4所示。其中,等高线为椭圆形,说明交互作用显著[13-14]。等高线的疏密可以看出杨木酶水解液和鱼粉蛋白胨对枯草芽孢杆菌生长的影响>杨木酶水解液和K2HPO4对枯草芽孢杆菌生长的影响>鱼粉蛋白胨和K2HPO4对枯草芽孢杆菌生长的影响。软件预测出的3种培养基组分的最优浓度为:3.20%(体积分数)杨木酶水解液、2.30%(质量分数)鱼粉蛋白胨、0.06%(质量分数)K2HPO4,最优条件的预测值OD600为15.85,对应活菌数为6.34×108CFU/mL。按预测得到的最优培养基组成进行5次重复试验,培养24 h后得到的OD600值为15.98,对应活菌数为6.39×108CFU/mL,与响应面优化试验所得预测值接近。这表明该模型较好地预测了试验结果,说明该模型和试验结果是可靠的。

图4 两因素交互作用影响枯草芽孢杆菌生长的响应面分析

2.4 枯草芽孢杆菌生长曲线

根据响应面优化得出的最佳培养基组成以及单因素试验优化后的最佳培养条件,分别绘制了以含相同质量浓度葡萄糖和木糖的混合单糖溶液作为对照碳源培养枯草芽孢杆菌的生长曲线(图5a)和以杨木酶水解液作为碳源培养枯草芽孢杆菌的生长曲线(图5b)。在0~3 h为枯草芽孢杆菌的迟缓期,3~24 h为对数生长期,24 h时枯草芽孢杆菌进入稳定期。随着枯草芽孢杆菌进入对数生长期,培养基中的葡萄糖被枯草芽孢杆菌大量消耗用于生长繁殖,同时培养体系中的木糖含量也缓慢减少。培养24 h后,即枯草芽孢杆菌进入稳定期,此时培养基中的糖浓度都趋于0 g/L。另外杨木酶水解液中还含有纤维二糖,由图5b可以看出枯草芽孢杆菌从第22 h开始利用纤维二糖,这说明枯草芽孢杆菌对酶水解液中糖的利用顺序为葡萄糖、木糖、纤维二糖。对比图5a与图5b可以看出,枯草芽孢杆菌在单糖溶液配制的培养基中,消耗碳源的速度更快,生长情况也较好。并且以相同质量浓度的单糖溶液作为碳源培养枯草芽孢杆菌所得到的活菌数略高,可达到6.65×108CFU/mL,而以杨木酶水解液作为碳源时,活菌数达到6.46×108CFU/mL。对比两种发酵培养基中发酵前后的pH可以发现,含酶水解液的培养基pH仅下降了0.84,而含单糖溶液的培养基pH发酵后下降了1.61,这是因为酶水解液中含有柠檬酸钠,调节了培养体系中的离子平衡。

a)以单糖溶液(葡萄糖∶木糖=5∶1,质量浓度比)为碳源;b)以杨木酶水解液为碳源。

由枯草芽孢杆菌的生长曲线可以看出,枯草芽孢杆菌能较好地利用酶水解液中的葡萄糖和木糖。同时也说明枯草芽孢杆菌以杨木酶水解液为碳源时,只需添加少量氮源以及无机盐即能生长良好。相较于传统微生物发酵所用的葡萄糖、蔗糖等培养基组分,杨木屑不属于粮食作物,且廉价易得,以杨木屑发酵所得的酶水解液作为碳源培养枯草芽孢杆菌,拓宽了杨木废弃物再利用的途径。但与已有研究进行对比,Yánez-Mendizábal等[15]利用大豆粉与糖蜜发酵枯草芽孢杆菌CPA-8,最大活菌数可达3.00×109CFU/mL,Zhang等[16]以玉米粉和黄豆粉培养芽孢杆菌Z-14,活菌数可达到1.85×109CFU/mL,活菌数略低,可能是因为杨木酶水解液成分复杂,其中所含的乙酸、乙酰丙酸等影响了枯草芽孢杆菌的生长。因此后续可通过脱毒、提高供氧等措施进一步提高菌体浓度。

3 结 论

1)以杨木酶水解液为碳源培养枯草芽孢杆菌,采用单因素试验对培养基组成和培养条件进行了优化。最终确定,当枯草芽孢杆菌以杨木酶水解液为碳源时,最适的氮源、无机盐、微量元素分别为鱼粉蛋白胨、K2HPO4、MgSO4。最佳培养条件为温度35 ℃、pH 7.0、转速190 r/min、初始接种量2.0%(质量分数)、装液量10 mL(相对于50 mL)。

2)响应面优化试验确定了3种最重要培养基组分的最佳浓度为:3.20%(体积分数)杨木酶水解液、2.30%(质量分数)鱼粉蛋白胨、0.06%(质量分数)K2HPO4。

3)在最优条件下对枯草芽孢杆菌进行培养,活菌数最终可达到6.46×108CFU/mL,比优化前的2.64×108CFU/mL有显著提高,发酵结束后杨木水解液中的单糖消耗率可达98.7%。

猜你喜欢

杨木鱼粉氮源
鸣秋·吉林杨木沟写生(中国画78cm×53cm 2021年)
鱼粉普遍上涨100~200元/吨,背后“推手”是什么?
疯狂!直击鱼粉飙涨,与国外鱼粉市场缘何倒挂?
硅烷偶联剂KH590对硅酸盐改性杨木表面性能的影响
鱼粉:秘鲁A季考察接近尾声,国内港口迎来B季集中到港
鱼粉:秘鲁疫情或将影响新捕季国内外鱼粉行情高位运行
悬崖上的杨木
去除脐橙白皮层的产酶培养基优化
拉曼光谱分析有机氮源促进乙醇发酵的机制
通过探讨氮源在青霉素发酵的过程中影响