重组新城疫病毒rL-RVG 对小细胞肺癌的溶瘤作用机制研究

梁冰，严玉兰

（1. 昆山市中医医院 呼吸科，江苏 昆山 215300；2. 江苏大学附属人民医院 呼吸科，江苏 镇江 212001）

0 引言

小细胞肺癌（Small cell lung cancer，SCLC）是目前恶性程度较高、治疗效果较差的肿瘤之一，溶瘤治疗主要通过溶瘤病毒选择性地感染靶细胞，不断复制，最终摧毁宿主细胞[1]；新城疫病毒（Newcastle disease vires，NDV）是众多溶瘤病毒中最常见且最具潜力的一种。相较于其他溶瘤病毒，NDV可以选择性地杀死癌细胞，它在癌细胞中复制效率是正常细胞的1万倍[2]。为此，我们将重组新城疫病毒rL-RVG感染至NCI-H446细胞株中，探讨rL-RVG对SCLC的溶瘤作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料。NDV、rL-RVG（哈尔滨兽医研究所）；人肺小细胞肺癌NCI-H446细胞株（中国科学院上海生科院细胞中心）；胎牛血清（WISENT公司）；DMEM细胞培养基（Gibco公司）；HRP-兔抗鸡二抗（Earthox 公司）；FITC-山羊抗鼠二抗、Cy3-山羊抗鸡二抗、RIPA裂解缓冲液（康为世纪公司）；PVDF膜（PALL公司）；显影液（Millipore公司）；核荧光染料（Hoechst33342）、Triton X-100、MTT、（Sigma-Aldrich 公司）；（Santa Cruz公司）、兔抗人半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）（ImmunoWay公司）；ECL增强型试剂盒（Amersham Bioseiences公司）

1.2 方法

1.2.1 免疫荧光法检测病毒蛋白的表达[3-4]：将NCI-H446接种在24孔板内盖玻片上培养4 h，加入稀释好的病毒液，继续培养24 h，洗涤3次。用4%的多聚甲醛4℃固定。洗涤10 min×3次，用0.3%的TritonX-100作用8 min，3%BSA室温封闭1h。洗涤3次，加入1∶150的鸡抗NDV一抗或1∶100的小鼠抗RVG一抗，4℃过夜。洗涤3次。加入1∶300的Cy3-山羊抗鸡二抗或1∶100的FITC-山羊抗鼠二抗，孵育1h。细胞核用0.2μmol/L Hoechst 33342作用30 min。封片，于荧光显微镜下观察。

1.2.2 MTT法检测病毒的抗增殖情况：用DMEM将病毒原液稀释到10-1、10-2、10-3、10-4浓度，将NCI-H446种植96孔板上，每孔100 μL，恒温箱过夜，第二天换DMEM维持液，在NDV和rL-RVG组分别加入相应的病毒稀释液，PBS为阴性对照组，设5个平行孔/组，调零孔为DMEM，培养24 h，加入20 μL MTT/孔，培养4h，用150 μL DMSO/孔溶解，摇床振荡，酶标仪上测定吸光度，重复实验3次，计算细胞生长抑制率[5]。

1.2.3 流式细胞术检测细胞早期凋亡：NCI-H446接种至6孔板，用NDV病毒（10-3稀释度）和、rL-RVG重组病毒（10-3稀释度）、PBS分别感染24 h后，PBS洗2次，按照试剂盒说明操作，上机。每组均设同种型对照，Cell quest软件获取数据，Win MDI 2.9 软件分析数据，实验重复3次。

1.2.4 Western blot法检测凋亡蛋白caspase-3的表达[6]：将NCI-H446种植于6孔板上，加入病毒液（10-3稀释度）及PBS。培养24 h后提取蛋白。PBS冲洗3次，加入细胞裂解液100 μL/孔，置于冰上裂解20 min，收集细胞，12000 g/min离心15 min，取上清到新的EP管，按5∶1加20 μL loading buffer煮沸5 min后-20℃储存备用。蛋白样品10 μL/孔上样，电泳，80V电压积聚蛋白，待Marker分开后调至120V。SDS-PAGE后电转至PVDF膜时间为90min。25℃下用5%脱脂奶粉封闭1 h，孵育一抗（1∶200）过夜。TBST洗10 min×3次后孵育HRP标记的二抗（1∶1000）60 min，TBST洗10 min×3次，内参为小鼠抗GAPDH（1∶10000），ECL发光剂在Typhoon9400扫描仪上扫描。扫描结果用北京赛制公司的LANE.1D软件进行灰度比值定量分析。重复3次后分析结果。

1.3 统计学分析。所有数据分析采用SPSS 20.0软件包进行分析。数据结果以均数±标准差（±s）表示，各组间数据的比较依据资料的性质，采用t检验或方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫荧光法检测rL-RVG及NDV在NCI-H446的表达。rL-RVG及NDV分别感染NCI-H446细胞24 h后，在荧光显微镜下可见，rL-RVG组NDV可在NCI-H446细胞中稳定表达，并且rL-RVG的感染效率较NDV高。

图1 重组新城疫病毒rL-RVG及NDV感染NCI-446细胞的表达及转染效率（×400）

2.2 rL-RVG和NDV分别感染NCI-H446细胞24h的细胞抑制率。稀释不同浓度的rL-RVG和NDV均对NCI-H446细胞的生长具有一定的抑制作用，且病毒浓度越高，对癌细胞的抑制作用越高，其中rL-RVG对SCLC的抑制效果较强，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 不同浓度的病毒感染NCI-H446细胞24h的生长抑制率

2.3 rL-RVG感染NCI-H446细胞后的细胞早期凋亡增多。利用流式细胞术检测病毒感染后的NCI-H446细胞，发现rL-RVG组细胞早期凋亡较多，而NDV组和PBS组细胞早期凋亡较少，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 重组新城疫病毒rL-RVG及NDV感染NCI-H446细胞24 h对细胞早期凋亡的影响

2.4 促凋亡蛋白caspase-3表达量增加。如图4A所示，caspase-3在rL-RVG组表达最高，并且高于NDV和PBS组。加入caspase-3抑制剂后，caspase-3表达量下降，rLRVG组表达最低。

图4 A rL-RVG及NDV感染NCI-H446细胞24 h后加入抑制剂前后凋亡蛋白caspase-3DE表达；图4B 加入抑制剂前后的灰度值

3 讨论

新城疫病毒隶属禽副粘病毒属，是一种主要感染禽类的鸡瘟病毒。相对与其他病毒载体，NDV载体还有如多优势，首先NDV是一种鸟类病原体，而我们选取的NDV LaSota为弱毒株，这就避免了病毒对人类的固有免疫力。其次，NDV能够稳定在不影响本身病毒特性的同时稳定表达外源基因。例如rL-RVG具有安全、稳定表达的特点。多项研究发现其NDV有明显的抑制肿瘤细胞生长作用，重组新城疫病毒比单独用NDV的肿瘤凋亡率显著升高或效果显著。NDV诱导的溶瘤机制之一是可以通过NDV病毒不断扩增，直接胀破肿瘤细胞，另一种是通过诱导凋亡途径实现，有实验研究发现NDV-HN能致人肺腺癌A549细胞凋亡，可以诱导Bcl-2下降[7]。谢晓娟等研究发现，NDV能够诱导NCI-H1299细胞的凋亡，可能与微丝骨架密切相关的RhoA/ROCK信号通路有关[8]。

本实验发现rL-RVG能够较强的抑制NCI-H446细胞株的生长，随着病毒浓度降低，抑制作用也减弱；免疫荧光法检测结果显示rL-RVG及NDV均能在NCI-H446内稳定表达，RVG能够提高NDV的转染效率，从而促进病毒进入宿主细胞，发挥溶瘤作用[9]。而细胞死亡主要通过细胞坏死和细胞凋亡两种方式，其中本实验的流式细胞术结果表明相较PBS组，rL-RVG、NDV组细胞早期凋亡数增多，且rL-RVG组较NDV组细胞早期凋亡增多（P<0.05），提示了rL-RVG的溶瘤作用可能与细胞凋亡有关。我们采用Western blot法检测了caspase-3的表达，结果显示，rL-RVG组caspase-3表达量最高，加入抑制剂后，caspase-3蛋白表达量减弱，由此可以证明，rL-RVG诱导的凋亡可能是caspase途径依赖的，并且rL-RVG的caspase凋亡途径作用更明显。

综上所述，rL-RVG可能是通过RVG增加NDV病毒的转染效率，进而增加了其抗增殖及促凋亡的作用，发挥较强的溶瘤作用。