痛泻要方对肝郁脾虚证IBS-D大鼠SCF/c-Kit信号系统的影响*

芮晓薇 郑思慧 赵方敏 蒋佳怡 柯雅妮 张 璐 蔡利军#

1 浙江中医药大学第一临床医学院 浙江 杭州 310053

2 浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

腹泻型肠易激综合征（IBS-D）是以反复发作的腹痛腹泻为临床特征的慢性功能性胃肠道疾病，常伴心理障碍。IBS-D发病可能与脑-肠轴功能紊乱、内脏高敏感性、肠道动力异常及精神心理因素等有关[1-2]。而内脏高敏感性、肠道动力异常与5-羟色胺（5-HT）、P物质（SP）等脑肠肽及SCF/c-Kit信号系统密切相关[3]。痛泻要方对于治疗肝郁脾虚证IBS-D具有良好疗效，然而其作用机制尚未完全明确，故本研究通过观测大鼠血清5-HT和结肠组织SP、SCF和c-Kit mRNA表达量的变化，探讨痛泻要方对肝郁脾虚证IBS-D的作用机制，为疏肝健脾方药在IBS-D中的运用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物：SD雄性大鼠24只，体质量200±20g。饲养条件：室温 20～24℃，相对湿度 40%～70%，噪音＜60dB，光照周期12h/12h。

1.2 实验药物：番泻叶、痛泻要方（炒白术30g，炒白芍20g，炒陈皮15g，防风10g），中药饮片由浙江省中医院中药房提供并进行质量鉴定。

1.3 实验试剂及仪器：大鼠SP ELISA试剂盒；大鼠5-HT ELISA试剂盒；BCA蛋白法含量测试盒(ADS-FDB005)；RNA提取试剂盒（TaKaRa，AHF1991D）；RT反转录试剂盒（TaKaRa，RR036A）；SYBR Green荧光定量PCR染料（TaKaRa，AK9301）。悬尾测试仪（济南益延科技发展有限公司，YLS-18A）；大鼠旷场（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，63007）；荧光定量PCR仪（ABI）。

1.4 造模及干预方法：具体如下。

1.4.1 药物制备：番泻叶水煎剂：番泻叶水浸泡5h，煎煮20min，过滤浓缩至含生药0.45g/ml药液备用。痛泻要方水煎剂：炒白术、炒白芍、炒陈皮、防风水浸泡30min，煎煮30min，过滤浓缩至含生药1.35g/ml备用。

1.4.2 建立模型：除空白组外，各组均采用番泻叶灌胃联合慢性束缚应激法建立[4]肝郁脾虚证IBS-D动物模型：连续14d番泻叶水煎剂［4.5g/(kg·d)］灌胃后叠加束缚，每日约2h。

1.4.3 药物干预：造模成功后开始治疗，给药剂量按大鼠与人体体表面积折算的等效剂量计算：痛泻要方组按生药6.75g/(kg•d)；空白组、模型组分别给予等体积生理盐水，灌胃量按0.50ml/100g计算，连续14d。

1.5 检测指标及方法：具体如下。

1.5.1 一般状态观察：造模与治疗前后，观察各组大鼠的精神状态、行为等，并记录体质量变化。

1.5.2 粪便性状测定：第28、42d观察并记录4h（8：00-12：00Am）内各组大鼠的粪便性状和粪点数。采用Bris‐tol分级评分[5]评价大鼠的腹泻情况。稀便率=大鼠所排稀便粒数/排便总粒数。采集大鼠粪便，称量记录粪便湿重，烘干后称量记录干重。计算公式：粪便含水量（%）＝（粪便湿重－粪便干重）/粪便湿重×100%[6]。

1.5.3 动物行为学评价：旷场实验[7]：于42d给药结束后，在安静无干扰、弱光照射、无参照物的环境下进行。大鼠适应环境1min后置于旷场箱中心格内，用Smart v3.0记录5min内大鼠活动情况。悬尾实验[8]：于42d给药结束后，将大鼠尾部固定于悬尾测试仪中成倒挂状态，共悬挂6min，适应2min，记录大鼠后4min内的静止时间（放弃挣扎，整个身体相对不动）。

1.5.4 标本采集：末次给药后，各组大鼠禁食不禁水24h，颌下静脉取血，离心取上清液，-20℃保存备用。采血后大鼠安乐死，剖腹截取结肠组织-80℃冻存备用。

1.5.5 ELISA法测定结肠SP、血清5-HT水平：严格按照ELISA试剂盒说明书操作，测定计算各样本的浓度。

1.5.6 qPCR法检测SCF、c-Kit的表达：严格按照试剂盒说明书进行。引物序列见表1。用实时荧光定量PCR仪及其分析软件进行扩增，计算Ct值，通过公式2-△△CT计算mRNA表达量。

表1 引物序列

1.5.7 相关性分析：用Peasron积差相关系数分析SCF、c-Kit的表达与SP、5-HT水平的相关性。

1.6 统计学方法：采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，多组间均值比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状态：模型大鼠精神萎靡，进食少，毛发松散光泽度低，粪便呈糊状或水样便。治疗后大鼠精神状态改善，进食、活动增加，皮毛较前整齐，粪便转为香肠状。各组大鼠无死亡或脱落。体质量比较见表2。

表2 给药前后大鼠体质量的比较（±s，g）

表2 给药前后大鼠体质量的比较（±s，g）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01。

给药后体质量356.69±22.70 311.75±25.71*355.46±13.14△组别空白组模型组痛泻要方组n8 8 8给药前体质量320.48±18.05 297.38±20.28*292.16±13.30*

2.2 各组大鼠粪便含水量、Bristol积分及稀便率的比较：见表3。

表3 给药前后各组大鼠粪便含水量、Bristol积分及稀便率变化（±s）

表3 给药前后各组大鼠粪便含水量、Bristol积分及稀便率变化（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01。

组别空白组模型组痛泻要方组给药后2.50±4.63 35.76±14.56*14.21± 8.34△n 8 8 8粪便含水量（%）给药前31.92±8.15 57.49±8.19*55.48±7.06*给药后31.62±8.31 56.86±6.05*33.88±7.85△Bristol积分（分）给药前3.00±0.76 6.00±0.76*6.13±0.84*给药后3.25±0.71 6.25±0.71*3.38±0.92△稀便率（%）给药前3.60±5.10 35.67±10.49*34.34±15.28*

2.3 动物行为学评价：各组大鼠旷场实验、悬尾实验的结果比较见表4。

表4 各组大鼠旷场实验及悬尾实验的比较（±s）

表4 各组大鼠旷场实验及悬尾实验的比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01。

组别空白组模型组痛泻要方组悬尾不动时间（s）95.38±13.98 124.00±13.41*102.63±16.19△n8 8 8总路程（cm）3827.60±379.47 1513.20±176.17*3475.43±458.72△运动速度（cm/s）13.99±2.04 6.22±1.39*12.35±1.15△中央停留时间（s）45.91±8.17 20.30±3.26*39.35±8.39△跨格次数（次）109.88±17.80 57.75±14.94*97.38±12.68△

2.4 各组大鼠血清5-HT、结肠SP水平比较：见表5。

表5 痛泻要方对大鼠血清5-HT、结肠SP水平的影响（±s）

表5 痛泻要方对大鼠血清5-HT、结肠SP水平的影响（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01。

组别空白组模型组痛泻要方组SP（ng/mg）2.67±0.99 9.16±1.34*6.60±1.04△n 8 8 8 5-HT（ng/ml）6.03±4.06 30.00±3.78*14.23±2.63△

2.5 各组大鼠结肠组织SCF、c-Kit mRNA表达比较：见表6。

表6 痛泻要方对大鼠结肠组织SCF、c-Kit mRNA表达的影响（±s）

表6 痛泻要方对大鼠结肠组织SCF、c-Kit mRNA表达的影响（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01。

组别空白组模型组痛泻要方组c-Kit/GAPDH 1.02±0.27 3.75±0.88*1.42±0.90△n8 8 8 SCF/GAPDH 1.01±0.11 3.94±0.70*1.25±0.46△

2.6 SCF、c-Kit mRNA表达与SP、5-HT水平的相关性分析：见表7。

表7 SCF、c-Kit mRNA表达与SP、5-HT水平的Pearson相关系数r

3 讨论

IBS-D属于中医学“腹痛”“泄泻”“郁证”范畴，本病病位在大肠，与肝、脾、肾密切相关，肝郁脾虚是导致IBS-D发生的重要病机。痛泻要方以白术为君，苦甘而温，燥湿补脾和中；白芍为臣，泻肝火，敛逆气，缓急止痛；陈皮为佐，辛苦而温，理气燥湿，醒脾和胃；再配伍少量防风，与术、芍相伍，辛能散肝，香能舒脾，风能胜湿以助止泻之功，又为脾经之引经药。四药相合，脾健肝和，痛泻自止。本研究发现，经痛泻要方治疗后，IBS-D模型大鼠粪便含水量、Bristol积分及稀便率均下降，表明痛泻要方可通过调节胃肠功能以改善大鼠腹泻的症状，旷场和悬尾实验结果提示，痛泻要方能有效改善肝郁脾虚型IBS-D大鼠的精神状态。

SCF是由骨髓基质细胞产生的一种多功能的酸性糖蛋白，c-Kit是由原癌基因c-Kit编码的I型跨膜糖蛋白，是SCF的配体。SCF/c-Kit信号系统调控着多种细胞的生长、发育、分化和凋亡，c-Kit与SCF结合后，启动Ras/Erk等下游通路，作用于肠道Cajal间质细胞（in‐terstitial cell of Cajal，ICC）、肥大细胞（mast cell，MC）等[3]与IBS-D发病相关的细胞。

国内外多项研究显示[3，9]，IBS的发病可能与SCF/c-Kit信号系统过度表达有关。SCF通过c-Kit受体诱导肠道MC发育活化增加[10]，引起MC分泌5-HT、类胰蛋白酶等，作用于神经末梢相应受体，导致内脏高敏及肠动力紊乱，类胰蛋白酶可激活肠神经释放SP[11]，SP、5-HT作用于ICC表面受体，将信号传递给平滑肌细胞，起到调节作用[12]。因此SCF/C-Kit信号系统过表达可能是IBS-D内脏疼痛感知、胃肠动力紊乱的共同环节之一。

本研究中，模型组大鼠结肠中SCF、c-Kit表达升高，痛泻要方灌胃后大鼠结肠组织SCF、c-Kit的mRNA表达明显降低，提示痛泻要方可明显降低肝郁脾虚证IBS-D大鼠SCF/c-Kit系统的过表达。同时，大鼠结肠SCF、c-Kit的表达与5-HT、SP水平呈显著正相关关系，一定程度上验证了脑肠轴中SCF/c-Kit信号系统对5-HT、SP的调节在IBS-D的发生发展中的作用。痛泻要方可能通过SCF/c-Kit信号系统调节5-HT、SP水平，从而改善IBS-D脑肠轴功能异常来达到治疗作用。但是SCF/c-Kit信号系统涉及Ras/Erk、JAK/STAT等多条下游通路[3]，痛泻要方治疗IBS-D的具体靶点有待进一步研究。