嗜冷黄杆菌培养基优化研究

柴静茹，卢彤岩，王荻，陈福广，李绍戊

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.黑龙江省水生动物病害与免疫重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150070；3.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306）

随着产业规模化程度的提高，养殖鲑鳟鱼患病死亡风险大幅提高。细菌性冷水病（Bacterial coldwater disease,BCWD）是一种广泛流行的细菌性疾病，患病鲑鳟的死亡率为10%～90%，给鲑鳟产业带来严重经济损失[1]。BCWD 的病原嗜冷黄杆菌Flavobacterium psychrophilum 呈革兰氏阴性，细长杆状，直径0.20～0.75 μm，长1.5～7.5 μm，具有圆形末端，虽无鞭毛或菌毛，但能产生滑动运动，最佳培养温度为15～18℃[2-6]。嗜冷黄杆菌宿主谱广泛且主要感染鲑科鱼类，目前已报道感染的鲑科鱼类有虹鳟Oncorhynchus mykiss、银鲑O.kisutch、大鳞鲑O.stshawytscha、山鳟O.clarkii、北极红点鲑Salvelinus alpinus、湖红点鲑S.namaycush、大西洋鲑Salmo salar、海鳟Salmo trutta trutta 和褐鳟Salmo trutta lacustris 等，其中虹鳟和银鲑最易感[7]。第一株嗜冷黄杆菌分离自美国，现已分布世界，在全球多个国家和地区的养殖或野生鱼类中均有报道[8,9]。

嗜冷黄杆菌属需氧菌，对营养和培养条件要求很苛刻，通常在脑心浸液琼脂、胰蛋白酶大豆琼脂、三糖铁琼脂和血琼脂等高营养浓度的培养基上不生长[7]。关于嗜冷黄杆菌增殖培养基的报道较多。最早用于分离嗜冷黄杆菌的培养基是Cytophaga 培养基，由0.05%胰蛋白胨、0.05%酵母提取物、0.02%乙酸钠和0.02%牛肉提取物配制而成（pH 7.0～7.2）[10]。Obach 等[11]在Cytophaga 培养基中加入10%胎牛血清促进了嗜冷黄杆菌的生长，但胎牛血清成本较高。Daskalov 等[12]利用Cytophaga 培养基作为基础培养基，加入0.5 g/L 的D-半乳糖、D-葡萄糖、L-鼠李糖和脱脂牛奶，在改良培养基上得到的菌落尺寸比单用Cytophaga 培养基大一倍，嗜冷黄杆菌的生长速度更快，产菌量更高，但也只达到106CFU/mL。目前科研领域使用最广泛的是胰蛋白酵母提取物培养基（tryptone yeast extract salts,TYES）的配方是：0.4%胰蛋白胨、0.04%酵母提取物、0.05%七水硫酸镁、0.05%无水氯化钙（pH 7.2）[13]。然而使用TYES培养基培养时间较长，一般需要至少4 d。本实验以TYES 培养基为基础，尝试筛选一种培养时间短、产菌量高、活力好、成本低及制备方法操作简单的嗜冷黄杆菌培养基。

1 材料与方法

1.1 材料

供试嗜冷黄杆菌CH06 株、CH07 株和CH08 株由本实验室分离自临床患病虹鳟的病灶及脾脏，并鉴定和保存。健康虹鳟购自辽宁本溪艾格莫林有限公司，平均体质量20～30 g。

TYES 液体培养基的制备：1 L 蒸馏水，4 g/L 胰蛋白胨，0.5 g/L 酵母提取物，0.2 g/L 无水氯化钙，0.5 g/L 七水硫酸镁，pH 调至7.2，121℃高压灭菌15 min。Biolog GEN III 微平板、接种液No.72401-IF-A和无菌一次性接种棉签购自美国BIOLOG 公司；L-脯氨酸购自上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 碳源的筛选

通过Biolog 微平板法确定嗜冷黄杆菌利用率最高的碳源。Biolog Gen III 96 孔微平板含71 种碳源、23 种化学敏感物质及阴性和阳性对照。将-80℃冻存的嗜冷黄杆菌CH06、CH07 和CH08 株于TYES 固体培养基上划线复苏，18℃恒温培养箱中倒置培养，直至长出单菌落且没有杂菌。

将Biolog Gen III 96 孔微平板从4℃冰箱中取出，室温条件下放置30 min，擦干净接种管外壁，放入浊度仪中，将浊度仪透光度调至100%，用无菌一次性接种棉签蘸取单菌落，放入接种液中搅拌，使菌落均匀分散，制成浊度为90%～98%T 的悬浊液，加入Biolog Gen III 96 孔板中，每孔100 μL。每隔24 h 使用酶标仪读取每个孔在590 nm 和750 nm波长下的吸光度值，连续读取7 d。以Gen III 微平板的A10 孔为对照，其他孔的吸光度值小于A10 孔的一半，定为“阴性”反应；其他孔的吸光度值大于A10 孔一半，定为“阳性”反应[14]。阳性反应的碳源为可利用碳源。微生物对不同碳源的利用能力，用颜色平均变化率（Average Well Color Development，AWCD）表示，计算菌株的AWCD 值随时间的变化，得到其利用碳源的平均活性[15]。

1.2.2 单因素试验

初步筛选出利用率最高的碳源后，进一步研究该碳源添加浓度对嗜冷黄杆菌增殖的影响，以确定最佳添加浓度。设置碳源的添加浓度分别为0.3 g/L、0.5 g/L 和1.0 g/L，将方法1.2.1 中复苏的嗜冷黄杆菌CH06 株按1∶100 的比例分别接种到TYES液体培养基、TYES+0.3 g/L 碳源液体培养基、TYES+0.5 g/L 碳源液体培养基和TYES+1.0 g/L 碳源液体培养基中，每组3 个重复，18℃150 r/min 震荡培养，每隔24 h 利用平板计数法计算菌落数量。随后选取CH07 和CH08 株进行结果验证。

1.2.3 添加碳源对菌落形态的影响

为比较各组不同配方培养基上生长的嗜冷黄杆菌形态有无差异，分别利用革兰氏染色和扫描电镜方法比较菌落的形态和大小。

1.2.4 添加碳源对菌株致病性的影响

为比较添加碳源培养基与TYES 培养基上生长的嗜冷黄杆菌毒力差异，给实验鱼尾柄肌肉按0.1 mL/尾的剂量注射菌悬液。菌悬液的初始浓度为1×108CFU/mL，每组10 尾。注射后每日投喂两次，投饵量为体质量的1.0%，每天记录临床症状和死亡情况，取濒死或死亡的实验鱼病灶及内脏器官进行细菌再分离和鉴定。空白对照组实验鱼注射等剂量的TYES 液体培养基。

1.3 数据分析

实验数据采用SPSS 26.0 软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）,多重比较采用Duncan’s法，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 三株嗜冷黄杆菌对碳源的利用情况

Biolog 分析结果表明，三株嗜冷黄杆菌的阳性反应很明显，对鉴定板中碳源的利用情况不完全相同。由图1 可知，CH06 株能够利用碳源L-脯氨酸、L-谷氨酸、L-组胺、葡糖醛酰胺、乙酸、龙胆二糖和奎宁酸；CH07 株能够利用碳源L-脯氨酸、L-谷氨酸、L-组胺、葡糖醛酰胺和乙酸；CH08 株能够利用碳源L-脯氨酸、L-谷氨酸、葡糖醛酰胺、乙酸、L-组胺和L-苹果酸。

图1 三株嗜冷黄杆菌在GEN III 微平板上的反应Fig.1 Reactions of 3 strains of F.psychrophilum on GEN III microplates

三株嗜冷黄杆菌的碳源利用随时间而变化。AWCD 值分析结果表明，菌株CH06 株在培养初始阶段对L-脯氨酸的利用率最高，且持续到碳源消耗殆尽；对L-谷氨酸、L-组胺、葡糖醛酰胺、乙酸、龙胆二糖和奎宁酸也有利用，但是利用率显著低于L-脯氨酸（图2-A）。CH07 株在前24 h 对葡糖醛酰胺的利用率最高；从24 h 开始，CH07 株对L-脯氨酸的利用率持续增高，48 h 及以后利用率显著高于L-谷氨酸、L-组胺、葡糖醛酰胺和乙酸（图2-B）。在培养初始阶段，CH08 株能利用葡糖醛酰胺、L-谷氨酸、乙酸和L-脯氨酸，48 h 才开始利用L-组胺，72 h 开始利用L-苹果酸（图2-C）。结果表明，嗜冷黄杆菌对碳源的利用效率由高至低依次为：L-谷氨酸＞L-脯氨酸＞葡糖醛酰胺＞乙酸＞L-苹果酸＞L-组胺。

图2 三株嗜冷黄杆菌对不同碳源的利用率随时间的变化Fig.2 Changes in utilization of carbon sources by three strains of F.psychrophilum with time

2.2 单因素试验

对不同碳源的利用表明，三株嗜冷黄杆菌对L-脯氨酸的利用率最高。因此，进一步比较了该碳源不同添加剂量对嗜冷黄杆菌CH06 株生长的影响。由表1 可知，CH06 株在添加不同浓度L-脯氨酸的TYES 培养基上生长24 h 后，细菌浓度达到8×106CFU/mL，显著高于TYES 组（P＜0.05）；48 h 时，0.5 g/L L-脯氨酸TYES 组的细菌浓度为3.5×107CFU/mL，分别是1.0 g/L、0.3 g/L L-脯氨酸TYES 组和TYES 组的1.59 倍、1.94 倍和11.67 倍；72 h 时，TYES 组的活菌数量降低，而实验组的活菌数量持续升高，0.5 g/L L-脯氨酸TYES 组的菌液浓度达5×107CFU/mL，是1.0 g/L 和0.3 g/L L-脯氨酸TYES组的2.50 倍，是TYES 组的250 倍。

表1 不同培养基对嗜冷黄杆菌CH06 株生长的影响Tab.1 Effects of different media on the growth of CH06 strain

2.3 CH07 株和CH08 株验证添加碳源的最佳浓度

在添加0.5 g/L L-脯氨酸的TYES 培养基上，嗜冷黄杆菌CH07 和CH08 株的生长结果表明（表2），CH07 和CH08 株在添加L-脯氨酸的培养基上培养24 h、48 h 和72 h 后，细菌浓度显著升高，高于TYES 对照组，与CH06 株结果一致。

表2 不同培养基对嗜冷黄杆菌CH07、CH08 株生长的影响Tab.2 Effects of different media on the growth of CH07 and CH08 strains

2.4 L-脯氨酸对嗜冷黄杆菌菌落形态的影响

染色结果表明（图3），在TYES 基础培养基和添加L-脯氨酸的TYES 培养基培养的三株嗜冷黄杆菌均为革兰氏阴性细长杆菌，形态无明显变化。扫描电镜观察显示，在TYES 基础培养基上生长的嗜冷黄杆菌平均长度为（1.83±0.22）μm，平均直径为（0.25±0.03）μm；在添加L-脯氨酸的TYES 培养上生长的嗜冷黄杆菌平均长度为（1.84±0.2）μm，平均直径为（0.25±0.02）μm。不同培养基上生长的嗜冷黄杆菌在形态和规格上无差异（图4）。

图3 革兰氏染色观察CH06 株形态变化Fig.3 The morphological observation of CH06 strain by Gram staining

图4 扫描电镜观察CH06 株形态变化Fig.4 The morphological observation of CH06 strain under a scanning electron microscope

2.5 L-脯氨酸对嗜冷黄杆菌致病性的影响

人工感染试验结果表明，在添加L-脯氨酸的TYES 培养基上培养的CH06、CH07 和CH08 株对虹鳟幼鱼均具有较强的致病性。试验鱼在攻毒48～72 h 后行动萎靡、食欲不振，注射处开始脓肿溃烂；剖检可见鳃苍白、肝脏苍白和脾脏肿大，伴有肠炎。与TYES 培养基上生长的嗜冷黄杆菌相比，添加L-脯氨酸培养的CH06、CH07 和CH08 株感染虹鳟后引发的临床病征出现时间和死亡率等均无显著差异。对照组鱼仅在肌肉注射处有轻微肿胀，无其他临床症状且无死亡（图5）。从人工感染试验鱼脾脏及注射肌肉处均分离到嗜冷黄杆菌。

图5 虹鳟幼鱼感染嗜冷黄杆菌后临床病征Fig.5 Clinical symptoms in juvenile rainbow trout infected with F.psychrophilum

3 讨论

鲑鳟鱼病原体嗜冷黄杆菌的培养难度较大，一是需要在低营养浓度的培养基上生长，二是需要较长的培养时间。面对嗜冷黄杆菌引起的BCWD 发病机制的研究和疫苗的大规模生产这两大问题，急需研发一种培养时间短、产菌量高、成本低及制备方法操作简单的嗜冷黄杆菌培养基。国外已经报道过几种改良的嗜冷黄杆菌培养基，除了Cytophaga 培养基，还有一种富含胰蛋白胨的基础培养基，即Anacker-Ordal 肉汤，其配方为：0.5%胰蛋白胨、0.05%酵母提取物、0.02%牛肉提取物和0.02%乙酸钠[2]。Daskalov 等[12]以Cytophaga 培养基为基础培养基，添加D-半乳糖、D-葡萄糖、L-鼠李糖和脱脂牛奶，培养嗜冷黄杆菌后尽管细菌量增多，也只有106CFU/mL。Crump 等[17]开发了胰蛋白酵母提取物麦芽糖培养基。Oplinger 等[17]研究表明，添加0.2%脱脂牛奶和1%马血清可以促进嗜冷黄杆菌增殖，提高培养效果，二者丰富了培养基的蛋白质含量，增加了嗜冷黄杆菌可用蛋白质来源的多样性，但马血清成本较高，且脱脂牛奶和马血清都需要过滤灭菌，操作不够便捷。Cepeda 等[18]在TYES 基础上，添加0.5 g/L 葡萄糖，培养的嗜冷黄杆菌在稳定期能达到5×109CFU/mL，高于TYES培养基（2×108CFU/mL）和CCM培养基（3×107CFU/mL）。嗜冷黄杆菌一直被认为是一种无法利用碳水化合物的细菌，葡萄糖在生长中的作用尚无法解释，有待深入研究[19]。

Biolog Gen III 96 孔微平板含碳源种类丰富，71种碳源中有单糖类、磷酸己糖类、氨基酸类、己糖酸类、羧酸类、酯类和脂肪酸类。本研究用Biolog Gen III 微平板法筛选适合添加及利用率最高的碳源。结果表明，氨基酸类中的L-脯氨酸为嗜冷黄杆菌CH06 和CH07 株利用率第一的碳源，为CH08 株利用率第二的碳源，综合三株菌利用碳源的情况选用L-脯氨酸作为添加碳源。

L-脯氨酸是一种结构与性质独特的生物蛋白质氨基酸，为亚氨基酸，分子量较小，水溶性比任何氨基酸都大，能发挥多方面生理功能。据报道，L-脯氨酸的积累与细菌渗透胁迫耐受性密切相关。Csonka[20]研究表明，鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium 的L-脯氨酸高产菌株获得了渗透抗性；Zaprasis 等[21,22]研究发现，枯草芽孢杆菌Bacillus subtlis 可积累胞内L-脯氨酸，对抗高渗透压的胁迫。刘玉霞等[23]最新研究发现：耐氧突变株Clostridium sp.Aeroto-AUH-JLC108 在有氧条件下生长时，获得了积累脯氨酸的能力，所以在相同接种条件下，在有氧条件下耐氧突变株的生长速度明显快于原出发菌株，生物量是原出发菌株在厌氧条件下的2～3 倍。这些研究结果或许能作为L-脯氨酸在嗜冷黄杆菌培养中发挥作用的依据。

尽管已有研究通过改良嗜冷黄杆菌培养基而提高了产菌量，但是缺乏改良培养基对菌株形态、大小和致病性影响的分析。本研究对TYES 培养基添加L-脯氨酸后培养的嗜冷黄杆菌进行革兰氏染色和扫描电镜观察，发现仍为细长、两端钝圆的革兰氏阴性菌，平均长度和直径与TYES 培养基培养的该菌几乎没有差异，也在文献报道范围内。为了判断改良培养基是否影响嗜冷黄杆菌毒力，本研究用嗜冷黄杆菌人工感染了虹鳟幼鱼，出现临床症状的时间、死亡率与对照组无明显差异，说明改良培养基不影响该细菌的毒力。本研究结果对于嗜冷黄杆菌的体外培养及规模化生产具有重要指导意义。