枸橘-壁虎药对治疗乳腺增生病的网络药理学研究

顾佳美，王 鑫，范 玲，殷海霞，唐晓龙，陈国新，金庆雷，金庆荣，金庆江

(1. 苏州市中西医结合医院，江苏 苏州 215101；2. 苏州市甪直人民医院，江苏 苏州 215101)

乳腺增生病又称为良性乳腺结构不良，是乳腺上皮细胞及纤维组织由于下丘脑-垂体-性腺轴调控的雌激素、黄体酮比例失衡所引起的不同程度增生，临床上表现为双侧或单侧乳房疼痛与肿块。乳腺增生病多发于中青年女性，在乳腺疾病中的发病率高达75%，严重的可发展为乳腺癌。中医认为乳腺增生病是由冲任失调、肝郁气滞、痰瘀互结所致，因此临床上多采用疏肝解郁、软坚散结、活血祛瘀、清热化痰的中药复方进行治疗[1]。金庆江主任医师为江苏省名老中医，吴门医派士材学派传承工作室主任，师承其父金里千先生，为士材学派第11代传承人，他继承了士材学派学术思想和父亲辨治乳腺增生病的学术经验，临床擅长采用枸橘配伍壁虎治疗乳腺类疾病，效果颇佳[2]。枸橘为芸香科植物枸橘Poncirustrifoliata未成熟的果实，具有理气和胃、消积化滞的功效，主要含有柚皮苷、橙皮苷等黄酮类和挥发油类成分，具有抗肿瘤、抗氧化等药理活性[3-4]。壁虎为壁虎科无蹼壁虎GekkoswinhonisGunther、多疣壁虎Gekkojaponicus等多种壁虎的干燥全体，具有祛风通络、散结止痛的功效，含有多种氨基酸类成分，大量研究表明壁虎治疗乳腺增生、恶性肿瘤、结核病等疾病疗效确切[5]。但枸橘、壁虎成分复杂，治疗乳腺增生病的作用机制尚不明确。网络药理学“多成分-多靶点-多通路”的研究方式与中医药整体观不谋而合，因此本研究从分子层面，基于网络药理学的方法研究枸橘、壁虎治疗乳腺增生病的作用机制。

1 材料和方法

1.1枸橘-壁虎成分及靶点的获取 从中药综合数据库(TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid/)、上海有机所化学数据库(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp)及文献中检索枸橘、壁虎的化学成分。基于Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)检索得到成分的smiles号，同时筛选出“Biological Test Results”项下标记为“active”“Human”的靶点作为成分的验证靶点。将smiles号输入至Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)中预测成分靶点。验证靶点及预测靶点共同作为壁虎及枸橘的成分靶点。

1.2乳腺增生病靶点的获取 应用在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM，http://www.omim.org/)以关键词“hyperplasia and mammary glands”检索得到疾病靶点，保留序列号前带“*”标记的基因作为乳腺增生病靶点。

1.4基因富集及通路分析 为分析枸橘、壁虎药对作用于乳腺增生病的主要生物过程和信号通路，进一步阐明成分的作用机制。应用Cystoscape 3.2.1中的Clue GO插件对枸橘、壁虎成分-乳腺增生病网络中的靶点进行GO生物过程(Gene Ontology Biological Process，BP)分析及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes)通路分析，设置物种为人，采用Bonferroni 法进行校正，P≤0.05。

2 结 果

2.1枸橘-壁虎化学成分 由于国内外对枸橘成分的研究较少，对TCMID数据库及上海有机所化学数据库中检索得到的成分进行确认、校正，补充文献报道2次以上的成分，共得到枸橘18个化合物[7-12]。由于壁虎中多肽、多糖等成分尚未明确至分子水平，未得到成分化学结构，查阅网络药理学相关文献后，以壁虎小分子氨基酸、核苷为研究对象，最终确定壁虎24个小分子化合物[13-16]。由于TCMSP数据库中未收录枸橘及壁虎，因此不采用常规的成分筛选指标口服生物利用度(OB)、类药性(DL)，保留全部成分。表1为药对中全部成分。

表1 枸橘-壁虎化学成分

2.2成分、疾病靶点的收集及映射 基于Swiss Target Prediction数据库检索出壁虎和枸橘预测靶点经统计并删除重复靶点后分别为478个和542个。利用Pubchem数据库得到壁虎验证靶点121个，枸橘验证靶点34个。取验证靶点和预测靶点的并集，得到壁虎530个靶点，枸橘561个靶点。通过OMIM数据库中检索出的乳腺增生病的靶点共44个。将成分靶点与疾病靶点通过Excel映射后，得到壁虎中作用于乳腺增生病的成分共11个，靶点11个(1个验证靶点，10个预测靶点)，枸橘中作用于乳腺增生病的成分共18个，靶点18个(2个验证靶点，16个预测靶点)，壁虎与枸橘共有靶点9个。图1为枸橘、壁虎成分靶点与乳腺增生病靶点交集的韦恩图，BH代表壁虎，GJ代表枸橘，HMG代表乳腺增生病。

图1 药对-乳腺增生病靶点韦恩图

2.3“药物-成分-靶点-疾病”网络图的构建 将29个成分和20个疾病靶点作用关系导入Cystoscape 3.2.1中，得到枸橘、壁虎成分-乳腺增生病网络图，网络包含节点49个，边120条，平均自由度4.898。椭圆形节点代表靶点，菱形节点代表药对成分，网络节点颜色随着自由度的增大，由黄色逐渐趋近于红色，结果见图2。

图2 枸橘、壁虎成分-乳腺增生病网络图

2.4网络分析 网络中的各节点在网络中的自由度、平均最短路径长度、介数值见表2 。对介数>0的16个靶点及24个成分通过公式(1)计算R值，按照R值由小到大进行排序。结果显示R值的大小与自由度排序不完全一致，由此说明网络中节点的重要性应从多方面考虑。ER、AR、CYP19A1、TERT在网络中的重要性远高于其他靶点，枸橘中大部分成分在网络中的关键性远高于壁虎中成分，其中佛手内酯对网络的影响最大。

表2 靶点网络拓扑参数

续表

2.5基因富集及通路分析

2.5.1GOBP分析 图3所示枸橘、壁虎成分-乳腺增生病网络中涉及的20个靶点进行GOBP分析后得到4组P≤0.05的10条生物过程，进一步分为一氧化氮生物合成过程的正调控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)；平滑肌细胞增殖的调节(regulation of smooth muscle cell proliferation)；哺乳(lactation)，新生血管形成中的细胞迁移(cell migration involved in sprouting angiogenesis)；前列腺增长(prostate gland growth)，乳腺发育(mammary gland development)，乳腺腺泡发育(mammary gland alveolus development)，乳腺上皮细胞发育(mammary gland epithelium development)，乳腺上皮细胞增殖(mammary gland epithelial cell proliferation)，乳腺导管形态发生分支(branching involved in mammary gland duct morphogenesis)。涉及的靶点有AR、ER、CYP19A1、TERT、CCND1、KDM5B、PTGS2、JAK2、MMP9、VEGFA、KDR、PPARG。

图3 枸橘、壁虎成分-乳腺增生病网络中涉及的20个靶点GOBP分析

2.5.2KEGG通路分析 对成分-疾病网络中涉及的20个靶点进行KEGG通路分析，结果显示P≤0.05的信号通路共17条，见图4。其中与乳腺增生病最相关的通路有催乳素信号通路、细胞血管内皮生长因子信号通路、雌激素信号通路。3条信号通路的相关基因及成分的网络关系图见图5，涉及的基因包括ER、PTGS2、CCND1、JAK2、MMP9、KDR、VEGFA、HRAS、PIK3CA，枸橘中的佛手内酯、橙皮苷、柚皮苷等成分以及壁虎中酪氨酸、肌苷等成分作用于上述靶点以治疗乳腺增生病。

图4 枸橘、壁虎成分-乳腺增生病网络中涉及的20个靶点KEGG通路分析

图5 枸橘、壁虎成分-乳腺增生病网络中成分-靶点-信号通路图

3 讨 论

乳腺增生病在中医上属于“乳癖”范畴，归属“积聚”类病证，由于痰浊瘀血的有形之邪积聚于乳络或情志不畅引起的脾失健运、肝气郁结所致。士材学派认为“积聚”分为内外因，外因即为寒邪引起的血脉瘀滞、津液停聚，内因是为情志不畅、饮食失常引起的肝脾不和。士材学派治疗“积聚”类病症常以温补药配伍理气药，以达到补而不滞的效果，加以滋阴潜阳、软坚散结类中药，起到去除肿块的作用[17]。枸橘具有理气化滞的功效，壁虎具有祛风通络、软坚散结的功效，两者配伍使用体现了士材学派的学术思想。

本研究最终确定29个化学成分，20个靶点构建枸橘、壁虎成分-乳腺增生病网络图。通过网络分析可知，枸橘中活性成分可能为佛手内酯、大根香叶烯 D、d-柠檬烯、β-石竹烯、柠檬苦素、橙皮苷等，作用于乳腺增生病的靶点明显多于壁虎中氨基酸类成分。研究表明佛手内酯通过SMAD4蛋白介导的泛素化诱导乳腺癌细胞中雌激素受体(ER)的消耗[18]，Francesca等[19]发现佛手内酯通过上调PI3K/AKT信号通路中同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)的表达从而产生乳腺癌细胞自噬体；Kim等[20]发现柠檬苦素可通过激活半胱胺酸蛋白酶-7(Anti-caspase-7)抑制人乳腺癌ER+、ER-细胞的增殖；d-柠檬烯通过上调转化生长因子-β1(TGF-β1)、6-磷酸甘露糖/胰岛素样生长因子Ⅱ(M6P/IGF-Ⅱ)表现出抗大鼠乳腺癌的作用或可能通过调节细胞色素P450影响乳腺癌中雌激素的代谢[21]；橙皮苷是枸橘中主要的黄酮类成分之一，其抗乳腺癌的作用机制与其抗氧化、诱导细胞凋亡、抗炎等有关[22]。包华音[23]发现无蹼壁虎多肽及多糖成分对人肝癌细胞bel-7402及人乳腺癌细胞MCF-7的增殖具有较强的抑制作用，但未能探究其作用机制；壁虎醇提物可能通过上调E钙黏蛋白表达，下调血管内皮生长因子及Racl蛋白表达从而抑制宫颈癌SiHa细胞的侵袭及迁移，而下调血管内皮生长因子的表达可抑制血管增生，进而阻止乳腺增生病发展为乳腺癌[24-25]；壁虎多肽混合物能显著下调B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)的表达，上调Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达，诱导人食管癌Ec 9706、KYSE450细胞凋亡。Li等[26]认为通过调整Bcl-2/Bax比值双向调节细胞凋亡进而达到治疗乳腺增生病的目的。壁虎中氨基酸类成分集中作用于ER、雄激素受体(AR)，目前尚未检索此方面更多的研究，可为后期研究壁虎多肽提取物治疗乳腺疾病提供思路。

结合成分-疾病网络图中靶点的R值，分析GOBP、KEGG通路相关靶点可知，ER、AR、CYP19A1、PTGS2、CCND1等为枸橘-壁虎药对治疗乳腺增生病的关键靶点。这些靶点不仅参与乳腺细胞发育与增殖过程、乳腺组织新生血管的形成过程，而且与催乳激素信号通路、雌激素信号通路、血管内皮生长因子信号通路相关联。枸橘、壁虎中成分通过调控关键靶点的表达，起到治疗乳腺增生病的目的。ER是目前治疗乳腺疾病最关键的靶点之一，其表达与乳腺组织的增生程度呈现正相关性，病理状态下，ER含量明显升高，促使乳腺细胞内线粒体、孕激素受体(PR)过度表达，影响乳腺细胞的正常代谢，降低乳腺组织自身修复能力，从而促进乳腺组织增生甚至癌变[27]。AR广泛存在于乳腺导管及腺泡上皮细胞中。正常情况下，AR可竞争性结合雌激素反应元件从而抑制乳腺上皮细胞增殖，当AR高表达时，在芳香化酶的催化下转化为ER，进而引发乳腺增生[28]。研究表明，AR可作为治疗ER、PR、人表皮生长因子受体2(HER-2)均为阴性的三阴性乳腺癌(TNBC)的潜在靶点，TNBC细胞中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的基因突变可能与AR的高表达有关，使用AR抑制剂治疗可阻断TNBC细胞增殖[28-29]。细胞色素P450芳香化酶(Arom)是雄激素转化为雌激素的关键酶及限速酶，其编码基因CYP19A1(Cytochrome P450 19A1)表达的多态性可通过影响Arom的活性、数量间接影响乳腺组织内的雌激素水平，继而引起乳腺增生或乳腺癌[30]。前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)又名COX2。研究发现，PTGS2与肿瘤细胞发生、发展的各个阶段密切相关，能促进肿瘤细胞的增殖及生长、促进肿瘤血管的生成、促进肿瘤细胞的侵袭和转移等，成为防治肿瘤的重要靶点[31]。Perrone等[32]通过免疫组化法检测出39例乳腺小叶上皮内瘤変(LIN)细胞中PTGS2和窖蛋白-1(CAV-1)的表达率分别为79.5%及94.9%，基于共焦显微镜发现PTGS2与CAV-1共定位于LIN的细胞窖内，推测PTGS2与细胞窖内多种信号因子共同影响乳腺癌的发展。CCND1是编码细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的基因，在乳腺癌、非小细胞肺癌等肿瘤细胞中高表达，为常见的肿瘤标志物。通过microRNAs过表达靶向下调CCND1在TNBC细胞中的高表达，可抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡[33-34]。

GOBP结果显示，药对有效成分所调节的靶点主要涉及乳腺组织的发育、增殖、新生血管的生成等生物过程，这些生物过程与乳腺组织增生甚至发展为乳腺癌息息相关。KEGG通路结果显示，药对靶点主要通过参与催乳素信号通路、细胞血管内皮生长因子信号通路、雌激素信号通路达到治疗乳腺增生病的目的。催乳素信号通路由催乳素(PRL)与催乳素受体(Prolactin receptor，PRLR)结合后激活下游JAK/STAT通路、P13K/AKT/mTOR通路、RAS/RAF/MAPK通路，从而参与调控各个组织。JAK/STAT通路为PRL-PRLR激活的主要通路，可影响乳腺上皮细胞的增殖及乳蛋白的合成；P13K/AKT/mTOR通路存在于乳腺癌、卵巢癌、肺癌等多种肿瘤中，参与细胞的生长、增殖与分化；RAS/RAF/MAPK通路参与PRL介导的乳腺上皮细胞增殖[35-37]。据此推断枸橘-壁虎可能通过影响PRL-PRLR下游通路中基因的表达直接或间接抑制催乳素的表达，进而抑制乳腺组织增生。细胞血管内皮生长因子信号通路参与肿瘤血管的生成、免疫调节或直接作用于肿瘤细胞，通过抑制细胞血管内皮生长因子或细胞血管内皮生长因子信号通路中其他靶点，可有效抑制肿瘤的发展。

综上所述，基于网络药理学的方法，本研究初步探讨了枸橘中佛手内酯、d-柠檬烯、柠檬苦素、橙皮苷等成分及壁虎中氨基酸通过ER、AR、CYP19A1、PTGS2、CCND1等靶点相互作用，共同调节催乳素信号通路、细胞血管内皮生长因子信号通路、雌激素信号通路，体现了药对多成分、多靶点、多通路治疗乳腺增生病的机制，为深入研究奠定了基础。但由于数据库中相关前期研究数据零星，未考虑成分含量、药代动力学等因素，因此本研究具有一定的局限性，需要进行更深入的研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。