高效液相色谱法测定番茄酱中番茄红素含量及其与色度值的相关性

杨雪凡，张 维，仇 凯，王正武,

（1.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；2.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京 100020）

番茄红素（lycopene），分子式为C40H56，是成熟番茄中最主要的疏水性无环类胡萝卜素，具有多种异构体，而自然界中普遍以全反式存在[1−3]。番茄红素含有13 个碳碳双键，具有强抗氧化性，是良好的自由基清除剂并能调节免疫系统平衡，目前已有其抗多种癌症（胃癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等）的相关报道，因此其生理活性倍受关注[3−6]。番茄是世界上饮食中番茄红素的主要来源，因此番茄红素也是番茄制品质量的重要考察指标。

现行的GB/T 14215-2008 标准及已有的相关研究中都将番茄红素总含量作为番茄制品的品质指标，其不仅提供了营养信息也提供了产品成熟度和新鲜度等质量信息[7−10]。番茄红素含量测定方法主要有分光光度法和高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），HPLC法较分光光度法更灵敏准确、可控性和分离度高、可排除其他色素干扰，但两者均存在前处理繁琐、番茄红素稳定性差易造成总量损失的缺点[7,11−13]。目前已有研究中均以番茄红素总量作为品质评价指标，但是已有研究发现人体中番茄红素60%以上以顺式结构存在，且顺式番茄红素在人体中具有更高的生物利用度及更高的抗氧化性[14−15]，番茄红素顺式异构体含量较番茄红素总量更是番茄制品品质优劣的重要体现。

同时，番茄红素也是番茄制品中主要呈色物质，因此色度值也是番茄制品品质划分的重要指标[16−17]。Li等[18]成功通过结合色度值和番茄红素含量评价番茄酱贮藏中的品质变化。Fu等[19]也成功通过比色法测定色度值结合番茄红素总量评价番茄的新鲜度。因此，番茄红素总含量和色度值都是番茄制品的主要理化指标。此外，番茄制品受加工手段影响大，全面评价番茄制品的品质仍需要检测可溶性固形物、pH、风味物质、添加剂等指标，但这存在过程繁琐，耗时长的缺点[18,20−21]。目前光谱检测不仅有着无损、快速、准确的特点，而且较比色法、HPLC法等能够获得更多的产品成分及结构信息，在产品加工及成品品质检测中有着极大潜力，但仍然存在定量精度远低于HPLC法的缺点[22−25]。因此，光谱技术仍需要结合HPLC、比色法才能更全面准确地表征番茄制品成分和结构信息[26−28]。本文建立HPLC检测番茄制品中番茄红素含量的方法，并研究了番茄红素含量与色度值间的相关性，为建立光谱同时检测番茄制品的色度值及番茄红素含量的方法研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

番茄酱及番茄汁类番茄制品（20 种不同品牌）市售产品；全反式番茄红素标准品 纯度>98%，河南奥科标准物质科技有限公司；二氯甲烷、甲醇 化学纯，Greagent；超纯水；甲醇、甲基叔丁基醚 MTBE、氢氧化钠、氯化钠、无水硫酸钠、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、叔丁基氢醌（TBHQ）、丁羟基茴香醚（BHA）其中，甲醇、甲基叔丁基醚 MTBE为色谱纯，其余均为化学纯，Adamas。

1260 Infinity II液相色谱 配有DAD二极管阵列及数据分析系统，美国安捷伦公司；超纯水仪Molecular公司；MS105DU分析天平 MettlerToledo公司；R-1020 旋转蒸发仪 BUCHI公司；SHB-2IIIA循环水多用真空泵 上海沪西分析仪器厂有限公司；MS-H-S10 磁力搅拌器 DLAB公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理及提取 精确称取样品1 g（精确至0.001 g）于 250 mL的锥形瓶中，先加入10 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液摇晃均匀，皂化30 min。然后分别加入50 mL蒸馏水和5 mL的饱和氯化钠，振荡使溶液分散均匀，用0.6 mol/L的稀盐酸溶液中和至中性（pH7，20 ℃）。再次加入50 mL的二氯甲烷磁力搅拌30 min后转入分液漏斗中，静置20 min，分别收集有机相和水相，重复上述步骤2 次至水相近无色，合并有机相。抽滤水相，残渣加入甲醇和二氯甲烷1:1 混合溶剂洗涤至无色。合并洗涤液和有机相，加入无水硫酸钠（约1.0 g）脱水，过滤后并于（40±1）℃旋转蒸发仪中减压浓缩，近干。氮气吹干，并用二氯甲烷定容至5 mL，过膜（0.45 μm）后置于2.0 mL样品瓶中，放−20 ℃冰箱备检。

1.2.2 HPLC检测条件 色谱柱：YMC-C30（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流动相A为甲醇，B为MTBE；流速：1.3 mL/min；检测波长：472 nm；柱温：20 ℃；进样量：10 μL；梯度洗脱条件，见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

1.2.3 标准曲线绘制 准确称取番茄红素标准品10.0 mg（精确至0.1 mg），用二氯甲烷溶液溶解并定容至10 mL，得到1000 μg/mL番茄红素标准液。分别准确移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2 mL标准储备溶液，用二氯甲烷稀释并定容至10 mL，得到浓度为10、20、40、60、80、100、200 μg/mL的标准工作溶液，取样进行超高效液相色谱分析，测定番茄红素峰面积，以番茄红素浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，以此建立标准曲线。

1.2.4 样品中番茄红素含量的计算 计算公式为：

式中：X表示样品中番茄红素的含量，mg/100 g；fi表示番茄红素异构体对全反式番茄红素的校正因子，其值分为1；W表示样品质量，g；∑A表示样品中全反式番茄红素及其异构体的面积之和；c表示稀释倍数；a表示标准曲线斜率；b表示标准曲线截距。

番茄红素得率计算公式：

式中：X表示样品中番茄红素的含量，mg/100 g；M表示样品质量，g。

1.2.5 样品色度值测定 每个样品取适量置于测试容器中，色差仪经黑白瓷片校准后进行L*、a*、b*值的测定，平行3 次取均值。并根据测得的L*、a*、b*值计算Chroma值和色相H°值：

1.3 数据处理

运用Excel、SPSS 20 及originPro 2017 软件进行图形绘制及数据分析。

2 结果与分析

2.1 前处理方法建立

2.1.1 提取溶剂选择 以番茄酱为原料，使用四种有机溶剂按照1.2.1 方法进行提取（n=9），提取结果见图1。从图1 可知，以二氯甲烷作提取溶剂所得番茄红素含量为23.03 mg/100 g（RSD=4.5%）均高于其他提取溶剂所提取出的含量，因此二氯甲烷提取效率最高，所以本实验最终选择二氯甲烷为提取溶剂。

图1 提取溶剂选择（n=9）Fig.1 The selection of solvent (n=9)

2.1.2 抗氧化剂的选择 为提高番茄红素在提取过程中的稳定性，分别选择0.5 g/L的叔丁基对苯二酚（TBHQ）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT)、丁羟基茴香醚(BHA)作为抗氧化剂添加入二氯甲烷溶剂中，测定同一番茄酱样品的番茄红素含量，由图2 可知，未添加抗氧化剂的样品提取的番茄红素含量为23.03 mg/100 g高于添加抗氧化剂样品的提取结果，因此抗氧化剂的效果均无显著提高，选择不添加。

图2 抗氧化剂选择（n=6）Fig.2 Selection of antioxidants (n=6)

2.2 高效液相色谱检测方法建立

2.2.1 最大检测波长的确定 由图3 可知，番茄红素的最大吸收峰在472 nm处，因此，选择472 nm为紫外检测波长，进行检测。

图3 番茄红素及其异构体色谱图及紫外吸收光谱图Fig.3 Chromatogram and ultraviolet absorption spectra of lycopene and its isomers

2.2.2 检测条件的优化实验 选择甲醇-甲基叔丁基醚作为流动相体系，选择三个流速梯度0.8、1.0、1.3 mL/min进行实验，考察不同流速对检测效率的影响，如图4 所示，提高流速可有效缩短样品中番茄红素特征峰的保留时间，由于图4（a）中1.3 mL/min流速下的色谱峰较其他两个流速下的色谱峰分离效果和峰形更好，且保留时间最短，因此效率最高，故选择流速1.3 mL/min为最终的色谱检测条件。

图4 不同流速下检测样品中番茄红素色谱图Fig.4 Chromatogram of lycopene in the samples was determined at different flow rates

2.2.3 检测方法对比 采用1.2.1 的提取条件，选择1.2.2 检测方法（方法1）、GB/T 14215-2008 的分光光度法（方法2）以及GB/T 22249-2008 的HPLC检测方法（方法3，使用C18色谱柱）检测市售的4 个不同品牌的番茄酱制品中番茄红素含量（表2），结果表明，方法1 的相对标准差在2.0%～4.4%之间，方法2 的相对标准差在0.9%～4.1%，方法3 的相对标准差在2.6%～5.5%之间，均具有良好的重复性。但采用C30色谱柱的方法1 测定的4 个样品的番茄红素总含量在11.13～72.51 mg/100 g之间，高于方法2 的8.80～46.23 mg/100 g和方法3 的8.89～54.28 mg/100 g。方法1 较方法2 番茄红素含量提高了26.48%～56.85%，相较于方法3 番茄红素含量提高了25.20%～33.59%。目前研究表明C30柱在番茄红素及其异构体的分离中有独特优势,可成功分离7 种以上番茄红素及其异构体[11,29−30]，因此，本文将以C30柱作为固定相研究番茄红素及其异构体的高效液相色谱分离检测方法。实验结果由图5 可见，C18柱相比于C30柱无法分离番茄红素及其异构体，峰形较差。

图5 不同检测方法检测样品中番茄红素的色谱图Fig.5 Chromatogram of lycopene in samples was determined by different methods

表2 不同市售番茄酱制品中番茄红素的3 种检测方法测定结果的比较（n=9）Table 2 Comparison of results obtained for determination of lycopene by HPLC in commercially available ketchup from three different manufacturers (n=9)

2.3 方法学验证

2.3.1 线性范围、检出限和定量限 按照1.2.3 方法建立标准曲线，得番茄红素标准曲线为y=68.23x+33.125，R²=0.9997，满足定量要求；检出限（LOD）指被分析物被检测出的最小质量或浓度，通常被定义为信噪比（S/N）比值为3，定量限（LOQ）要求S/N比值一般为10。测定得LOD为0.15 μg/mL，定量限为0.25 μg/mL。

2.3.2 重复性测定 取三种市售不同品牌的样品，同一样品取9 份平行进行HPLC检测，记录峰面积值，按番茄红素标准曲线计算含量及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）结果如表3 所示，相对标准偏差在2.8%～4.5%之间，表明该方法有良好的重复性。

表3 HPLC方法的重复性实验结果（n=9）Table 3 Results of repeatability obtained by HPLC (n=9)

2.3.3 加标回收率检测 采用加标回收实验对方法的准确度进行评价，向已知含量的样品中加入番茄红素标准液，按照样品处理方法对加标样品预处理后，采用超高效液相色谱仪进行测定，重复6 次，以峰面积计算含量、加标回收率。

由表4 可知，四种目标物的平均回收率为98.3%～99.6%，表明此检测方法准确度良好。

表4 番茄红素加标回收率实验结果（n=6）Table 4 Recovery of lycopence by HPLC (n=6)

2.4 番茄制品色度值与番茄红素总含量的相关性研究

2.4.1 样品中番茄红素含量测定及色度值测定 采用本实验建立的方法对市售20 种番茄制品（番茄酱、番茄汁）样品进行番茄红素含量的检测，结果如表5 所示。由表可知市售番茄制品的番茄红素含量为2.05～ 72.51 mg/100 g，亮度L*为15.83～39.79，色差值a*/b*在0.59～1.24 之间，总体颜色偏红，且L*和a*、a*/b*值越高，番茄制品颜色越鲜红好看。

表5 色度值及番茄红素含量检测结果（n=3）Table 5 Chromaticity values and content of lycopene in samples (n=3)

2.4.2 番茄红素异构体分布情况 通过液相色谱图获得各异构体在番茄制品中的含量，由表6 可知，首先，市场番茄制品中主要的番茄红素为全反式结构，所测定的20 种番茄制品所含的番茄红素中76.41%～93.36%为全反式番茄红素，其余主要为5z、9z、13z三种顺式结构的异构体。所测定样品中0%～11%为5z-番茄红素，0%～6%为9z-番茄红素，2%～14%为13z-番茄红素。番茄制品中反式番茄红素平均总占比88.06%，顺式番茄红素平均总占比达11.94%，而Gregory等[31]发现天然生番茄中反式番茄红素占比为89.70%，顺式番茄红素占比10.30%，可以看出番茄制品由于加工及储藏等因素使部分反式番茄红素出现了顺式异构化，且顺式番茄红素在人体中生物利用度比全反式高，因此番茄制品中顺式异构体的存在对于总番茄红素含量计算是不容忽视的。

表6 番茄红素及其异构体在番茄制品中的分布情况（n=3）Table 6 Distribution of lycopene and its isomers in tomato products (n=3)

2.4.3 相关性分析 测得样品色度值如表7 所示，将测得的不同品牌番茄制品色度值与其番茄红素含量进行Pearson相关性分析，结果表明番茄酱的番茄红素含量与其红值a*和Chroma值有极为显著的正相关（P<0.01），与a*/b*、H°值有显著的正相关（P<0.05），表明a*越高，番茄酱红色越深则其番茄红素含量越高，而番茄红素与蓝值b*、亮度值L*、（a*/b*）2值无显著相关性。

表7 番茄制品中番茄红素含量与色度值的相关性分析Table 7 Correlation analysis between color value and content of lycopene of tomato products

2.4.4 回归分析 将番茄红素含量分别与a*、a*/b*、Chroma、H°值分别进行回归分析，结果如表8 所示，经过线性和非线性（二次项、三次项、幂函数、指数）回归分析发现，a*与番茄红素含量的三次回归分析得到最好的R2=0.689，未达到良好的拟合效果。因此，番茄红素含量与番茄制品的色度值间相关性不强，可能是由于原料、添加剂、加工方法等不同而导致成品色度值差距较大。因此，番茄制品的色度值不能单独作为番茄制品中番茄红素含量的评价标准。

表8 线性回归分析结果Table 8 Regression coefficients of chromaticity values

3 结论

采用高效液相色谱法建立了对番茄酱制品中番茄红素含量检测方法，并进行了方法学评价。通过优化前处理条件及检测条件，最终获得的方法检测限为0.15 μg/mL、定量限为0.25 μg/mL，加标回收率在98.3%～99.6%之间，相对标准偏差在2.8%～4.5%之间，则该方法有良好的灵敏度、重复性和准确性，且分离了番茄制品中主要的四种番茄红素异构体，表征了更具体的番茄红素营养信息，适用于市售番茄酱及番茄制品中番茄红素含量的精确测定。番茄红素含量与红值a*、a*/b*、Chroma、H°值间存在正相关（P<0.05），与L*、b*值无明显相关（P>0.05），但经过线性及非线性回归分析发现a*和番茄红素含量的三次回归达到最佳拟合效果（R2=0.689）。由于不同原料、加工手段及添加剂的添加导致市售番茄制品的色度值和实际番茄红素含量相关性较差，单一的番茄红素含量无法替代番茄酱中色差值的检测，需要完善番茄酱中其他色素，如β-胡萝卜素、叶黄素等色素的相关方法。