青海不同产地羌活红外光谱分析

李美雎，刘 叶，尚 军，陈海娟

(青海师范大学生命科学学院，青海 西宁 810008)

羌活(Notopterygiumincisum)的主要药效成份是挥发油和香豆素类，李兆奎等[1]运用红外光谱方法对铁皮石斛和几种常用的混淆品进行了对比分析，可以迅速、准确的将几种药品区分开。刘明地等[2]采用红外光谱法对枸杞药材进行测定质量。陈燕等[3]为了提高羌活的质量标准，使用高效液相色谱测定分析；吴方斌等[4]用傅里叶变换红外光谱技术测定羌活、宽叶羌活的根茎和根药材的一维红外光谱和二维相关红外光谱，通过计算二阶导数光谱，定量测定峰的强度，并进行光谱解析、主成分分析快速鉴别羌活和宽叶羌活两种基原植物药材，实验结果表明羌活与宽叶羌活一维红外光谱的特征峰不同，可鉴别羌活和宽叶羌活。沈亮等[5]测定羌活种子在4 000～400 cm-1范围内的吸收峰，然后将红外光谱法与SIMCA模式识别法和系统聚类法相结合并快速、准确地将羌活种子鉴别出来。羌活喜凉爽阴湿、耐寒、怕强光，适于寒冷湿润气候，青海省的海东地区(主要是化隆县、互助县柏门峡、循化县、民和县、大通县)，果洛州(主要是久治、达日、班玛县和玛可河、军工地区)等地均有羌活和宽叶羌活分布[6，7]。红外光谱已经成为了中药化学成分组成、结构、含量研究的重要方法，是中成药、中药炮制、中药材鉴别分析的有效手段，在中药定量检验及定性鉴别中的应用价值得到公认。目前，关于青海不同产地羌活红外指纹图谱构建尚未报道。

1 研究方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 傅立叶变换红外光谱仪 美国Perkin Elmer公司Spectrum Two。

电子天平METTLER TOLEDO(XP205 DeltaRange)。

YP-2压片机 上海山岳科学仪器有限公司。

1.1.2 药品与药材 溴化钾(KBr，光谱纯)碎晶购于天津博君科技有限公司。

实验用羌活采挖于青海省互助、玛可河、红军沟、久治、松多、大通、班玛等地且均经尚军副教授鉴定；羌活对照药材采购于九康中药市场。

1.2 方法

1.2.1 样品制备 将样品进行粉碎、研磨，过150目筛，放置烘箱中60 ℃恒温干燥至恒重，将样品粉末与溴化钾碎晶进行制品 ，溴化钾空白片作为对照。

1.2.2 仪器测试条件 一维红外光谱的扫描范围为4 000～400 cm-1，每张光谱累加扫描64次，分辨率为4 cm-1，扫描过程中实时扣除二氧化碳和水蒸气干扰。

1.2.3 精密度的测定 将采于互助北山的样品连续测定5次，所得红外光谱图的相关系数为0.999，RSD值为0.000%，表明仪器精密度良好。

1.2.4 重复性试验 将采于互助北山的样品，按供试品制备方法平行制备5份，分别测定，所得红外光谱图的相关系数为0.962，RSD值为2.390%，表明方法重复性良好。

1.2.5 红外光谱的测定 先将溴化钾空白片置于红外光谱仪中，扫描，得空白背景片的一维红外光谱。再将样品片置于红外光谱仪中，扫描，得到样品片的一维红外光谱。

1.2.6 一维红外光谱的归一化 将样品收集得到的一维红外光谱经坐标转化(纵坐标为吸光度)，基线校正，光谱归一化，得到标准图谱。仪器自动识别峰的阈值设为0.01 A(峰强)。

1.2.7 二阶导数光谱计算 对已归一化的一维红外光谱进行二阶导数计算，13点平滑，即得二阶导数光谱。仪器自动识别峰的阈值设为0.0005 A(峰强)。

2 结果与分析

2.1 不同产地羌活一维谱及相关性分析

由表1可知，久治产羌活与红军沟、大通产羌活相比化学成分差异较小，相关系数在0.900以上，与其他地方产羌活相比化学成分差异较大，相关系数在0.900以下；红军沟产羌活与玛可河、班玛产羌活相比化学成分差异较大，相关系数在0.900以下，与其他地方产羌活相比化学成分差异较小，相关系数在0.900以上；大通产羌活与玛可河、班玛产羌活相比化学成分差异较大，相关系数在0.900以下，与其他地方羌活相比化学成分差异较小，相关系数在0.900以上；玛可河产羌活与其他地方的羌活相比化学成分差异较大，相关系数在0.900以下；松多产羌活与久治、玛可河、班玛产羌活相比化学成分差异较大，相关系数在0.900以下，与其他地方的羌活相比化学成分差异较小，相关系数在0.900以上；互助产羌活与久治、玛可河、班玛产羌活相比化学成分差异较大，相关系数在0.900以下，与其他地方的羌活相比化学成分差异较小，相关系数在0.900以上。

表1 青海不同产地羌活相关系数测定结果

不同产地羌活植物的一维红外光谱相似，主要吸收峰位于3 424～3 392、2 928～2 925、2 857～2 854、1 747～1 737、1 628～1 627、1 516～1 513、1 460～1 428、1 378、1 268～1 257、1 157、1 072～1 031、773、576～529、472 cm-1等处(图1)。其中，3 424～3 392 cm-1为羟基伸缩振动吸收峰；2 928～2 925 cm-1为亚甲基C-H反对称伸缩振动吸收峰；2 857～2 854 cm-1为亚甲基C-H对称伸缩振动吸峰；1 747～1 737 cm-1为酯羰基C=O伸缩振动吸收峰；1 628～1 627 cm-1为C=O或C=C伸缩振动吸收峰(包括由蛋白质中C=O伸缩振动和N-H弯曲振动产生的酰胺Ⅰ带)；1 516～1 513 cm-1为苯环骨架振动吸收峰；1 460～1 428和1 378 cm-1可能为C-H弯曲振动吸峰；1 268～1257、1 157、1 072～1 031 cm-1为C-O伸缩振动吸收峰；950 cm-1以下为苯环的骨架振动峰。

图1 羌活一维叠加图

2.2 不同产地羌活二阶导数光谱的比较

由于在1 800 cm-1之前会受-OH的影响，而800 cm-1之后基线漂移过大，故选择1 800～800 cm-1范围内的羌活(如图2)进行分析。在羌活二阶导数光谱中使用垂直光标标记，显示1 746、1 628、1 605、1 580、1 545、1 515、1 469、1 457、1 446、1 157、1 130、1 076、988 cm-1是几个地方羌活的共同峰。

图2 羌活植物的二阶导数叠加图

2.3 羌活主成分分析

将羌活一维红外光谱经吸光度转换、基线校正及归一化后，以吸光度为量化指标进行主成分分析。

由于3 400～2 800 cm-1波数处受测试环境水分的影响较大，缺乏特征性，而800～400 cm-1波数处基线不稳，也缺乏特征性。故选取红外光谱测试中特征表达稳定的1 800～800 cm-1波数处作为羌活主成分分析特征波数区间，选取不同产地的羌活红外一维谱在1 741、1 628、1 516、1 453、1 377、1 265、1 037 cm-1的7个共有峰，以吸光度为指标进行主成分分析。其KMO值为0.7，p=0.00，说明所选7个共有峰适宜做主成分分析，结果如表2，第一主成分累计方差为90.579%，第二主成分累计方差为6.955%，说明前两个主成分即可解释7个红外吸收峰变异的97.534%，即前两个主成分可以利用资料量的97.534%；经旋转成分矩阵计算因子最终的得分后，进一步计算各产地羌活化学成分累积量综合得分，结果如表3所示，不同产地羌活累积化学成分含量具有明显差异，其特征表现为班玛羌活>羌活对照药材>红军沟羌活>玛可河羌活>大通羌活>久治羌活>互助羌活>松多羌活。

表2 解释的总方差

图3 旋转空间中的成分图

表3 成分因子得分变量

2.4 聚类分析

将羌活一维红外光谱经吸光度转换、基线校正及归一化后，以吸光度为量化指标进行聚类分析。

羌活样品的主要吸收峰共6个数据点，即相对应的吸收峰A值，SPSS17.0软件进行聚类分析，结果如图4所示。从系统聚类分析图可以看出，可以将青海不同产地羌活分为两大类，久治、互助、大通、松多、玛可河产的归为一类，红军沟、班玛产的归为一类。

图4 不同产地羌活聚类分析图

3 讨论

通过红外光谱技术测定化合物在4 000～400 cm-1的特征吸收峰对其进行定性分析，红外吸收峰吸光度的高低反应了含量高低。由于中药材产地不同，其次生代谢产物在结构类型及有效成分含量方面均存在一定的差异性，通过测定中药材红外指纹图谱，在宏观上可反应中药化学成分类型及相互关系，并通过不同产地间中药材一维红外指纹图谱及二阶导数光谱的峰形、出峰位置及相关系数进行分析，找出相互间的关系，所建图谱指纹性强，方法简单、分析速度快、灵敏度强。在一维红外图谱的基础上，经吸光度转化、基线校正和归一化，由于在1 800 cm-1之前会受-OH的影响，而800 cm-1之后基线漂移过大，选择1 800～800 cm-1范围进行分析，以特征峰吸光度为量化指标，选择特征性强的共有特征峰进行主成分分析和聚类分析，评定中药材化学成分累积量，建立以中药材化学物质为基础的中药质量评价标准及不同产地间中药材的化学成分累积量品质关系评价。

但由于中药材化学成分复杂，药理活性物质基础不明，仅建立以化学物质为特征的指纹图谱，还无法满足中药材“谱—效”关系的质量控制要求。

目前，现行2015版《中华人民共和国药典》羌活项下收载品种有羌活和宽叶羌活，其质量控制指标以测定羌活醇、阿魏酸苯乙醇酯、异欧前胡素及镰叶芹二醇含量为其指控标准，并规定羌活醇和异欧前胡素的总量不得少于0.40%，而对二者之间的含量变化关系未作要求。实验通过构建青海7个产地羌活整体红外指纹图谱，定性定量的分析了青海7个不同产地羌活品质及相互关系。结果表明：7个产地的羌活样品中有7个共有峰，化学成分累积量从高到低依次为班玛、红军沟、玛可河、大通、久治、互助、松多产羌活，且不同产地的羌活一维红外图谱及二阶导数光谱均存在一定差异，说明青海7个不同产地羌活所含化学成分的种类及含量存在一定差异，且即便是化学成分类型相似，但化学成分累积量也存在一定差异，进而影响其品质的差异。通过红外光谱一维和二阶导数图光谱的构建，结合主成分分析与聚类分析可以定量、定性对羌活进行系统的质量评价。