石墨烯对大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌耐药基因接合转移的影响和机制探索研究

彭雪霞, 魏 飞, 王丽芳, 董辉伟, 谭 蓉, 程春燕, 杨 栋*, 李君文*

(滨州医学院公共卫生与管理学院， 山东烟台 264000)

抗生素主要是由细菌、霉菌或其他微生物产生的次级代谢产物或人工合成的类似物，能够抑制微生物的生长甚至将它们杀死，在防治细菌性疾病方面，抗生素发挥了至关重要的作用，人类在医疗、食品、农业等方面颇有受益〔1-3〕。现如今抗生素已成为全球已成为当前最常用的药物，随着抗生素在临床上的引入和滥用〔4〕，在抗生素选择压力下不可避免地会产生耐药性，人类也在不断地寻求新的抗菌药物〔5〕。目前研究发现临床、饮用水、废水、土壤等环境中均存在着大量的耐药菌和耐药基因〔6-10〕，更加表明抗生素的滥用引发的抗生素耐药问题日趋严重。 至今为止，研究发现细菌间发生基因水平转移的主要方式有 3 种，环境中最常见的方式为接合转移〔11〕。目前认为土壤、污水、生活垃圾和医院垃圾混合的污水处理厂是耐药基因传播的重要场所〔12〕。纳米材料作为一种可能的环境污染物质，其安全问题受到全世界的广泛关注〔13〕，且目前研究发现纳米材料能促进环境中耐药基因进行水平转移〔14〕。石墨烯是一种具有独特的二维碳原子单层纳米结构的材料,有优异的导热性、导电性以及吸附性而被广泛应用〔15-16〕，且随着石墨烯的大量生产和使用，特别是应用于基础设施建设环境中，将会导致其大量残留，可能对环境中耐药基因的扩散产生影响。本研究以大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌为研究对象，在一定条件下探讨石墨烯对耐药基因水平转移的影响及规律。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

1.1.1菌株 研究中采用的菌株为带有RP4质粒的大肠埃希菌E.coli MG1655，是目前研究结合转移常见的供体菌之一，该菌株携带卡那霉素、氨苄青霉素和四环素抗性基因。研究中的受体菌是具有美罗培南抗性基因的肺炎克雷伯杆菌，实验室保存。

1.1.2石墨烯及相应浓度贮备液的配置 石墨烯G835836购自麦克林试剂网，纯度≥99%。用电子分析天平(型号：AE2460S)分别称取0.2 g、0.1 g、0.05 g、0.025 g、0.0125 g、0.006 g、0.002 g石墨烯，每份均加入高压好的PBS(磷酸盐缓冲液)10 ml震荡摇匀，使之浓度分别达到20 mg/ml、10 mg/ml、5 mg/ml、2.5 mg/ml、1.25 mg/ml、0.6 mg/ml、0.2 mg/ml，常温放置备用。

1.1.3培养基 (1)LB培养基：LB肉汤Miller，购自美国BD公司。用分析天平准确称取25 gLB肉汤粉末，加无菌蒸馏水定容至1 L，高压121 ℃灭菌20 min后冷却备用。 (2)LB琼脂培养基：LB肉汤Miller(美国BD公司)、琼脂粉15 g(北京索莱宝科技有限公司)，加蒸馏水定容至1 L，高压121 ℃、20 min灭菌后放入电热鼓风干燥箱55 ℃备用。使用前煮沸，待冷却至50 ℃左右加入抗生素混匀后使用。

1.1.4抗生素 实验所用盐酸四环素溶液50 mg/ml采自生工生物工程上海有限股份有限公司，美罗培南三水标准品采自北京索莱宝科技有限公司。配制美罗培南三水标准品溶液，用电子分析天平(型号：AE2460S)标准称取0.05 g美罗培南加入10 ml无菌蒸馏水溶解，使之溶度达到5 mg/ml。四环素和美罗培南均用 0.22 μm 微孔滤膜过滤后分装，冻存于-20 ℃冰箱备用。

1.1.5试剂及实验器材 (1)试剂：PBS磷酸盐缓冲液(PH7.2-7.4)，购自北京索莱宝科技有限公司。取缓冲液一包，加入2 L无菌蒸馏水溶解，高压121 ℃灭菌20 min 后冷却备用。 (2)实验器材：15 ml离心管、10 ml离心管、30 ml离心管、1 L及2 L圆椎瓶、培养皿、离心机(ΜNIVERSAL)、微型漩涡混合仪(XW-80A)、台式恒温震荡器(QE-1)等。

1.2 液相接合将大肠埃希菌接种于含有40 μg/ml四环素LB培养基中，同时肺炎克雷伯杆菌接种于含有2 μg/ml美罗培南的LB培养基中，在37 ℃下150 r/min振荡过夜培养16 h后，在6000 r/min下离心5 min，弃去上清后用灭菌的PBS溶液离心洗涤菌液2次，用PBS重悬菌液后测定OD 600，根据OD值调整菌液至特定密度后备用，并立即进行后续实验。

1.2.1石墨烯浓度对大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌耐药基因接合转移的影响 均取等体积、等密度的供体菌和受体菌各4.75 ml 菌液1∶1混合均匀，在各制备好的悬液中加入石墨烯悬液0.5 ml(处理组)、PBS磷酸缓冲液0.5 ml(对照组)，使体系中石墨烯终浓度分别为0 μg/ml、1000 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml、125 μg/ml、62.5 μg/ml、30 μg/ml、10 μg/ml，各体系震荡摇匀，在37 ℃电热恒温培养箱中培养8 h，其中每隔2 h震荡摇匀一次。作用8 h后后取出进行接合子筛选。

1.2.2初始菌浓度对石墨烯对大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌耐药基因接合转移的影响 取9.5 ml初始菌密度分别为109、108、107、106的混合(1∶1)菌液各4份，向其中3份(设置3个平行)中加入0.5 ml浓度为10 mg/ml的石墨烯贮备液使其终浓度达到500 μg/ml，另外1份中加入0.5 mlPBS作为空白对照。将所有接合菌液混匀后，迅速放置到37 ℃的电热恒温培养箱中进行接合，接合8h后取出进行接合子筛选。

1.3 接合子的筛选水平接合转移结束后将菌液按梯度稀释后倾注在双抗LB培养基选择平板上，放于37 ℃电热恒温培养箱中培养36 h后计算接合子数，并计算耐药基因水平转移率。 为检验选择培养基平板上筛选的耐药细菌均为接合子，排除大肠埃希菌或肺炎克雷伯杆菌自发突变子的干扰，每次实验在设立上述组别的同时还分别设立单独大肠埃希菌对照组和 单独肺炎克雷伯杆菌对照组，处理及筛选方法与接合组相同。

1.4 接合子验证每项实验均在双抗选择培养基平板上随机挑取3个单个接合子菌落，培养在含有40 μg/ml四环素和2 μg/ml美罗培南的LB培养基中，放于台式恒温震荡器中37 ℃、150 r/min振荡培养过夜，观察接合子生长情况。

1.6 统计方法处理采用SPSS 22.0统计软件对数据进行方差分析或非参数秩和检验，有显著性差异后使用Dunnett检验比较实验组和对照组的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 石墨烯浓度对大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌耐药基因接合转移的影响石墨烯(浓度范围10 μg/ml-1000 μg/ml)对大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌耐药基因接合转移的影响(如图1所示)。空白对照组的接合转移频率约为2×10-5，浓度为10 μg/ml的石墨烯与空白对照无显著差异。加入浓度分别1000 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml、125 μg/ml、62.5 μg/ml、30 μg/ml的石墨烯干预接合转移后，接合转移频率与空白对照组相比明显升高，最高为浓度500 μg/ml，达到空白对照组60倍左右。随着石墨烯浓度逐渐升高，接合转移频率呈现逐渐升高的趋势，在浓度为500 μg/ml的时候达到高峰。当石墨烯浓度达1000 μg/ml时仍能促进接合转移，但是其促进作用要低于500 μg/ml，但依然高于空白对照组。这些结果均表明石墨烯可以促进大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌的接合转移，且结合转移频率与浓度相关。

图1 石墨烯浓度对大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌耐药基因接合转移的影响

在石墨烯对大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌耐药基因接合转移的影响中，石墨烯可以促进接合转移过程。与对照组相比，石墨烯浓度为1000 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml、125 μg/ml、62.5 μg/ml、30 μg/ml时能明显促进接合转移过程，且差异有显著性意义(*P<0.05、**P<0.01)，浓度为10 μg/ml也能明显促进接合转移过程，但差异无显著性差异(P>0.05)

2.2 初始菌浓度对大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌耐药基因接合转移的影响在石墨烯浓度为500 μg/ml时，初始菌浓度对石墨烯对大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌耐药基因接合转移的影响(如图2所示)。接合菌液浓度为106-109CFU/ml时，随着接合菌液浓度的升高，接合转移频率明显呈现上升的趋势，109CFU/ml时达到相应空白对照组的70倍左右。当接合菌浓度约为106CFU/ml时，空白对照组和实验组无显著差异。结果均表明石墨烯可以促进大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌耐药基因的接合转移，且结合转移频率与初始菌液浓度相关。

图2 初始菌浓度对大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌耐药基因接合转移的影响

2.3 接合子验证每项实验随机挑取的3个单个接合子菌落在含有40 μg/ml四环素和2 μg/ml美罗培南的LB培养基均生长良好。将接合子清洗2遍后将菌液按梯度稀释后倾注在双抗LB培养基选择平板上，放于37 ℃电热恒温培养箱中培养，均有良好生长。

在初始菌浓度对石墨烯对大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌耐药基因接合转移的影响中。接合菌液浓度为106-109cfu/ml时，随着接合菌液浓度的升高，接合转移频率明显呈现上升的趋势，且107-109cfu/ml时与对照组相比，有显著性差异(*P<0.05、**P<0.01)。当接合菌浓度约为106cfu/ml时，空白对照组和实验组无明显差异(P>0.05)。

3 讨论

石墨烯可以显著地促进大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌耐药基因的接合转移，在石墨烯浓度为10 μg/ml-500 μg/ml时，随着石墨烯浓度的升高，结合转移的促进作用逐渐增强；在浓度为500 μg/ml-1000 μg/ml时，促进作用又开始逐渐减弱，但也明显超过对照组。在接合条件为37 ℃、菌液浓度为108CFU/ml、结合时间为8 h的作用体系下，石墨烯浓度为250 μg/ml时，接合转移频率较对照组上升约40倍左右，500 μg/ml 石墨烯干预下产生的接合转移频率最高，是空白对照组的60倍左右，随后开始下降。在石墨烯浓度为500 μg/ml、初始菌浓度为106-109cfu/ml时，均对大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌耐药基因接合转移有明显的促进作用。且随着接合菌液浓度的升高，接合转移频率明显呈现上升的趋势，109CFU/ml时达到相应空白对照组的70倍左右，当接合菌浓度约为106CFU/ml时，空白对照组和实验组无显著差异，此结果与一些研究成果相似〔17〕。

已有一些研究表明，纳米材料可以促进细菌的接合转移过程。主要是通过纳米材料激发细菌的氧化抗氧化反应，影响细菌细胞膜的通透性，为供体菌和受体菌的细胞膜融合和DNA 跨膜转运提供适当的条件。纳米材料可以产生活性氧(ROS)进而破坏细胞膜、损害DNA，对细菌有杀伤作用，导致细菌死亡〔18-19〕。适当的纳米材料浓度能显著地促进细菌的接合转移过程，高于一定浓度时促进效率则降低〔14〕。也有研究表明，trbBp基因和trfAp基因是调控RP4接合转移的两个主要的调控基因〔20〕，纳米Al2O3可以促进这些基因的表达进而促进结合转移过程〔14〕，石墨烯作为纳米材料中的一种，它是否也可促进这些基因的表达从而促进接合转移过程，这一结果还有待下一步实验验证。石墨烯除了具备纳米特性，还在工业领域中应用来提高其他材料的韧性〔21〕，不知这其中除了纳米材料促进结合转移之外，是否还存在石墨烯充当分散剂提供供、受体菌之间的连接从而促进接合转移过程，这些问题都有待深一步的探讨。