丁酸梭菌与嗜酸乳杆菌固态发酵豆粕的工艺优化

■李 祥 李 浩 潘春梅 何金环 索江华

（河南牧业经济学院食品与生物工程学院，河南郑州 450046）

豆粕中含有胰蛋白酶抑制剂、植物凝集素、α-淀粉酶抑制因子和大豆抗原等抗营养因子[1]，限制了豆粕在肉鸡、断奶仔猪等幼龄动物饲料中的大量使用，若用量较大，会导致消化不良或腹泻等疾病的发生[2-4]。豆粕经微生物固态发酵可有效消除抗营养因子[5]，降解大豆抗原，释放游离氨基酸及多肽等[6]。经发酵产生的多肽不仅可提高豆粕的消化利用率，而且多肽具有吸收耗能低、吸收速率快、不易饱和等特点，使发酵豆粕的营养价值进一步提高[7]，常以多肽含量作为发酵豆粕评价的指标[8-9]。目前乳酸菌类发酵豆粕应用较多，如植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和唾液乳杆菌等发酵豆粕[10-14]。丁酸梭菌作为动物肠道中的厌氧型有益菌，可与其他有益菌群协同共生[12，15-16]，可产生丁酸、维生素、氨基酸、酶等多种代谢产物及益生因子，抑制肠道有害菌，提高动物抗病力、免疫力，减少发病率，还可减少饲料中抗生素的使用，并已成为重要的抗生素替代品[17]。研究表明，丁酸梭菌在不同基质中进行固态培养，豆粕是其最佳的培养基质[18-19]，利用丁酸梭菌与植物乳杆菌固态混菌发酵豆粕已有报道[20-21]，但丁酸梭菌与嗜酸乳杆菌混合固态发酵豆粕研究较少。因此本研究采用响应面分析法，以发酵豆粕多肽含量为指标，对丁酸梭菌与嗜酸乳杆菌固态发酵豆粕的最佳工艺进行优化，并为提高豆粕消化利用率、改善动物生产性能提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌种丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌，为本实验室筛选保藏。豆粕购于郑州某饲料企业，粉碎并过80 目筛备用，其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

722S型可见光分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；K9840 型半自动凯氏定氮仪，济南海能仪器股份有限公司；H650型高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SH220N型石墨消解仪，济南海能仪器股份有限公司；DNP-9272型恒温培养箱，上海鸿都电子科技有限公司；SW-CJ-50KBS 型双人超净工作台，苏州净化设备有限公司；PHS-3C型pH计，海佑科仪器仪表有限公司。

1.3 培养基配制

1.3.1 RCM培养基

可溶性淀粉1.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、牛肉粉10.0 g/L、酵母粉3.0 g/L、L-半胱氨酸盐酸0.5 g/L、葡萄糖5.0 g/L、乙酸钠3.0 g/L、琼脂0.5 g/L，pH 6.7～6.9，1×105Pa灭菌30 min。

1.3.2 MRS培养基

牛肉膏5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、酵母浸出粉4.0 g/L、吐温80 1 mL、磷酸氢二钾2.0 g/L、柠檬酸三铵2.0 g/L、硫酸锰0.05 g/L、乙酸钠5.0 g/L、硫酸镁0.2 g/L、琼脂15.0 g/L，pH 6.3～6.5，1×105Pa灭菌30 min。

1.3.3 发酵种子液

分别从MRS和RCM固体培养基中挑取一环接种至其相应的液体培养基中，37 ℃培养48 h。然后按1%的比例将其接种至液体培养基中扩大培养24 h，获得种子液。

1.3.4 固体发酵培养基

豆粕45.0 g、麸皮5.0 g，灭菌水适量，自然pH。

1.3.5 发酵培养基将50 g豆粕装入250 mL锥形瓶中，加适量的水混匀，121 ℃条件下灭菌20 min。水料比根据试验设计而定[22]。

1.3.6 固态发酵方法

将固体发酵培养基分装于250 mL 三角瓶中，将培养好的发酵种子液按一定的接种量接种到含豆粕的固态发酵培养基中，搅拌均匀，静置厌氧发酵[23]。

1.4 测定方法

凯氏定氮法测定发酵产物中酸溶性蛋白的含量，茚三酮显色法测定发酵产物中游离氨基酸的含量，多肽（%）=酸溶性蛋白（%）-游离氨基酸（%）[24]。

1.5 试验方法

1.5.1 单因素试验设计

1.5.1.1 丁酸梭菌与嗜酸乳杆菌接种比例对发酵多肽含量的影响

接种量为15%，水料比为1∶1，培养温度为37 ℃，发酵时长为48 h，研究丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌不同接种比例（1∶1，1∶2，2∶1，2∶3，3∶2）对发酵多肽含量的影响，设3次平行试验。

1.5.1.2 发酵温度对发酵多肽含量的影响

接种量为15%，丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌接种比例为1∶1，水料比为1∶1，发酵时长为48 h，研究发酵温度（30、33、35、37 ℃和40 ℃）对发酵豆粕多肽含量的影响，设3次平行试验。

1.5.1.3 发酵培养基水料比对发酵多肽含量的影响

接种量为15%，丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌接种比例为1∶1，发酵温度为37 ℃，发酵时长为48 h，研究水料比（0.4∶1.0，0.6∶1.0，0.8∶1.0 和1.2∶1.0）对豆粕多肽含量的影响，设3次平行试验。

1.5.1.4 发酵时间对发酵多肽含量的影响

接种量为15%，丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌接种比例为1∶1，水料比为1∶1，发酵温度为37 ℃，研究发酵时长（24、36、48、60 h 和72 h）对发酵多肽含量的影响，设3次平行试验。

1.5.1.5 接种量对发酵多肽含量的影响

丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌接种比例为1∶1，水料比为1∶1，培养温度为37 ℃，发酵时长为48 h，研究接种量（6%、9%、12%、15%和18%）对发酵多肽含量的影响，设3次平行试验。

1.5.2 响应面法优化丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌发酵豆粕多肽的工艺条件

1.5.2.1 Plackett-Burman（PB）设计

PB设计是一种2水平的试验设计方法，是通过最少量试验次数挑选出对发酵多肽含量有显著性影响的因素的试验方法。本试验选取单因素优化试验中对发酵多肽含量影响较大的5个因素来进行PB 试验，每个因素取高、低2 个水平，以多肽含量为响应值R，共进行12 次试验，其中预留6 个空项作为虚拟变量进行误差分析。对接种量、水料比、接种比例、发酵时长和发酵温度5 个单因素进行PB 设计，筛选出对发酵多肽含量有显著性影响的因素，其水平编码表见表1。

表1 PB试验设计因素水平

1.5.2.2 响应面试验优化设计

根据Box-Behnken 试验设计原理，通过PB 试验后，筛选出3个影响最显著的因素，分别为接种量、接种比例、水料比，以多肽含量为试验指标，设计3因素3 水平包括5 个中心点的17 次试验，以优化丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌固态发酵豆粕多肽的条件，确定最佳发酵工艺，响应面编码及水平见表2。

表2 响应面试验因素水平和编码

1.6 数据处理与分析

试验数据经3 次平行试验，以“平均值±标准差”表示，经Origin pro 2018 软件作图，Design-Expert 12软件进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验（见图1，图2）

图1 接种比例、发酵温度、水料比和发酵时长对发酵豆粕多肽含量的影响

由图1A、1B 可见，接种比例和发酵温度分别在1∶2～1∶1和30～37 ℃之间时，多肽含量随接种比例和温度增加而增大，在接种比例为1∶1 和发酵温度为37 ℃时达到最大，多肽含量分别为10.33%和10.43%，随着接种比例和发酵温度的继续增大，多肽含量出现下降趋势。因此，选取丁酸梭菌与嗜酸乳杆菌的接种比例为1∶1 和发酵温度为37 ℃作为豆粕发酵最佳条件。由图1C、1D 可见，水料比和发酵时长分别在0.4∶1～0.8∶1和12～48 h之间时，多肽含量随水料比和发酵时长增加而增大，在水料比为0.8∶1和发酵时长为48 h时达到最大，多肽含量分别为10.91%和10.21%，随着水料比和发酵时长的继续增大，多肽含量出现下降趋势。为得到更好的发酵条件，选取最佳水料比为0.8∶1，最佳发酵时长为48 h。由图2可见，丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌接种比例为1∶1，水料比为1∶1，发酵温度为37 ℃，发酵时长为48 h，当接种量为6%～12%时，多肽含量随着接种量增加而增大，在接种量12%时达到最大，15%和18%的接种量发酵豆粕后多肽含量有所下降，均为10.43%。因此，选取12%为最佳接种量。

图2 不同接种量对发酵豆粕多肽含量的影响

2.2 PB试验设计与结果

使用软件Design-Expert 12，选用n=11的PB设计表，5个变量分别为接种量（A）、接种比例（B）、水料比（C）、发酵温度（D）和发酵时长（E），预留6个虚拟选项作为误差分析，设计出12组试验，响应值R为发酵多肽含量（%），结果如表3所示。

表3 PB试验设计与结果

在表4各因素主效应分析结果中，当P<0.05时，说明该因素对多肽含量的影响为显著，并且P越小越显著。试验结果显示对多肽含量影响的显著性的排序为B>A>C>D>E，所以最终选取接种比例(B)、接种量(A)和水料比(C)三个影响显著的因素进行响应面优化试验。

表4 各因素主效应分析

2.3 响应面优化试验结果与分析

2.3.1 响应面优化试验因素分析结果

根据Box-Behnken 设计试验原理，应用Design-Expert 12 对接种量A、接种比例B 和水料比C 三个因素进行响应面分析试验，设计3 因素3 水平包括5 个中心点共17个试验，结果如表5所示。

表5 响应面试验设计及结果

2.3.2 响应面试验结果的方差分析

利用Design-Expert 8.0.6 软件对表5 试验数据进行拟合分析，建立二次回归模型：R=9.38+0.13A+0.15B+0.29C-0.09AB+0.19AC-0.32BC-1.37A2-0.76B2-1.28C2，并作方差分析。结果如表6 所示，回归模型F值为187.38，差异极显著（P<0.000 1），失拟项不显著（P=0.089 2>0.05），因此说明该模型适合本试验。回归方程决定系数R2=0.995 9，R2Adj=0.990 6说明该试验与模型拟合程度很好，自变量与响应值(多肽含量)之间线性关系显著，可以用于该反应的理论推测，表明99.59%的多肽含量的变化都可以被该模型解释，符合预期方程。因此，该模型可以用于数据分析和多肽含量的预测。由表6可知，各因素对多肽含量影响顺序为：水料比(C)>接种比例（B）>接种量(A)，其中一次项B、C因素、交互项BC以及2次项A2、B2、C2对响应值多肽含量具有极显著影响（P<0.01），交互项AC 对响应值多肽含量影响显著（P<0.05）。

表6 二次多项模型及各项的方差分析

2.3.3 各因素交互作用响应面结果与分析

通过Design-Expert 12软件获得二次响应面回归模型，并分析和创建相应的响应面。利用回归模型绘制的每两种因素交互作用的3D响应面和等高线图如图3～图5所示。

利用响应面3D图可高效直观地找到各参数之间的交互作用和最大响应值，曲面越陡，显示该因素对多肽含量的影响越显著，曲面平缓则相反。等高线图表示在同一椭圆形的区域内含量是相同的，其中心含量最高，由中心向边缘含量逐渐减少。椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则表示两因素交互作用不显著。

图3 中接种比例与接种量交互作用的等高线图为圆形，表明它们的交互作用对多肽含量的影响不显著。由图4 的等高线图可见，其椭圆较扁，表明水料比与接种量的交互作用对多肽含量的影响较显著。由图5 的等高线图可见，其椭圆更扁更密集，表明水料比与接种量的交互作用对多肽含量的影响更显著。由图3响应面3D图可以看出，曲面较为平缓，接种比例与接种量的交互作用不显著。由图4 响应面3D 图可以看出，其3D 曲面坡度稍陡，水料比与接种量的交互作用对多肽含量的影响较显著。由图5 的响应面图可以看出，其3D曲面坡度更陡，水料比与接种比例的交互作用对多肽含量的影响更加显著。当接种比例固定不变时，多肽含量随着水料比的提高而表现出先增多后减少的趋势；同样当水料比固定时，多肽含量随着接种比例的提高也表现出先增多后减少的趋势。综合上述分析，对发酵豆粕多肽含量影响的3个因素排列顺序为水料比(C)>接种比例（B）>接种量(A)，与方差分析的结果一致。

图3 接种量与接种比例交互作用响应面与等高线图

图4 水料比与接种量交互作用的响应面与等高线图

图5 水料比与接种比例交互作用的响应面与等高线图

2.4 验证试验

根据获得的回归拟合方程，利用Design-Expert 12软件的Optimization 命令进行条件寻优，结果得到最佳发酵条件为：A=12.16%、B=1.04、C=0.82。因此，丁酸梭菌与嗜酸乳杆菌发酵豆粕的最佳条件修正为接种量12.2%，丁酸梭菌与酸菌接种比例为1∶1，水料比为0.8。在该条件下多肽含量的理论预测值为9.40%，经过3次平行试验，测得实际发酵豆粕多肽含量平均值为9.64%，与预测值相差不大，说明该模型具有良好的拟合性，能较好地模拟和预测丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌固态发酵豆粕的工艺条件。

3 讨论

利用不同菌株对豆粕进行发酵，不仅可以降解豆粕中的抗营养因子，而且发酵后产生有益的代谢物如小肽对培养的动物细胞还具有特殊的促进作用[25]。因此，提高豆粕发酵产肽率将为动物的生长发育提供更高的营养价值，其中发酵豆粕生产中菌株选择及发酵工艺优化尤其重要。丁酸梭菌作为一种芽孢杆菌，与乳酸菌的作用类似，是极具潜力的饲用益生菌，既能如食品一样安全，针对腹泻、肠炎等肠道疾病又能如药物一样有效[26]。因此，对丁酸梭菌与嗜酸乳杆菌混合固态发酵豆粕工艺进行优化，不仅可提高豆粕的小肽含量，而且还可获得更多有益菌群的活菌数和代谢产物等。

陈洁梅等[22]以芽孢杆菌固态发酵豆粕和以多肽含量为指标，采用单因素试验和Box-Behnken响应面分析法对豆粕固态发酵工艺条件进行优化研究，其发酵豆粕的多肽含量为347.7 mg/g。吝常华等[23]应用正交法对解淀粉芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母混菌固态发酵豆粕工艺进行优化，豆粕经混菌发酵后，小肽含量较未发酵组分别提高了8.68倍，为10.42%。钱森和等[8]应用响应面法以发酵产物可溶性蛋白（包括游离氨基酸和小肽）作为测定指标，选用枯草芽孢杆菌、啤酒酵母和黑曲霉组合对豆粕进行发酵工艺优化，结果表明，枯草芽孢杆菌和黑曲霉混合菌固态发酵豆粕，大豆肽含量最高为8.73%。王哲奇等[24]应用Box-Behnken响应面法对枯草芽孢杆菌和米曲霉混合发酵豆粕生产大豆多肽的条件进行了初步优化，其发酵大豆多肽的理论含量为23.91%。Su等[20]报道以乳酸杆菌和丁酸梭菌为菌种固态发酵豆粕的最佳工艺参数，结果表明，在初始含水量50%条件下，发酵2 d提高了发酵豆粕中细菌的活菌数、乳酸含量和豆粕的降解率。

本试验测得发酵豆粕多肽含量为9.64%，与吝常华等[23]、钱森和等[8]及王哲奇等[24]研究结果基本一致，但由于发酵菌株选择不同，发酵工艺各不相同，前人研究发酵豆粕采用枯草芽孢杆菌与霉菌或酵母组合，因这些菌株的耗氧和产酶能力较强，因而豆粕降解为小肽效果较好。其中Su等[20]以乳酸杆菌和丁酸梭菌为菌种固态发酵豆粕，测定的指标主要为活菌数、乳酸含量和豆粕的还原糖含量，小肽含量未见报道；陈洁梅等[22]和王哲奇等[24]研究结果也因菌株和发酵工艺不同差异较大。本试验中丁酸梭菌是极其严格的厌氧菌，发酵生产的得菌率低，限制了它的广泛应用，因此本试验应用单因素试验和响应面分析法对丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌混合发酵豆粕进行工艺优化，不仅可提高豆粕小肽含量，提高豆粕的营养价值，还可调节肠道菌群平衡，抑制大肠杆菌等有害菌繁殖，保护肠道健康，减少疾病的发生，有助于减少饲料中抗生素的使用。

4 结论

本试验首先对丁酸梭菌与嗜酸乳杆菌发酵豆粕中接种量、接种比例、水料比、发酵温度和发酵时长5个因素进行单因素试验，得到最佳发酵条件为丁酸梭菌和嗜酸乳杆菌接种比例为1∶1，水料比为0.8∶1，培养温度为37 ℃，发酵时长为48 h，接种量为12%。以多肽含量为指标进行PB 实验，筛选得到对多肽含量影响最显著的因素为接种量、接种比例和水料比。通过Box-Behnken 响应面分析试验，以多肽含量为响应值，建立了二次多项回归数学模型，通过统计学分析进行了显著性检验，对各因素的交互作用进行分析，最终得到丁酸梭菌嗜酸乳杆菌固态发酵豆粕多肽的最佳发酵条件为：丁酸梭菌与嗜酸乳杆菌接种比例为1∶1，水料比为0.8∶1，接种量为12.2%，通过模型预测的最大发酵豆粕多肽含量为9.40%。在此发酵条件下验证试验的结果为9.64%，结果说明通过响应面法能够较好地优化发酵工艺条件，并能预测实际发酵豆粕多肽含量，对于生产具有实践指导意义。