低饲粮阴阳离子差补镁对山羊体液酸碱平衡、血钙与镁、瘤胃发酵参数的影响

2021-07-22马政发吴文旋吴佳海

饲料工业 2021年13期

■马政发许可吴文旋，2* 吴佳海

（1.贵州大学动物科学学院，动物营养与饲料科学研究所，贵州贵阳 550025；2.贵州大学新农村发展研究院，贵州省山地畜禽养殖污染控制与资源化技术工程实验室，贵州贵阳 550025；3.贵州省畜牧兽医研究所，贵州贵阳 550005）

低血钙是围产乳畜众多营养代谢性疾病中的核心疾病，其典型特征是血钙水平降低及代谢活动紊乱失调[1-2]，引起肌肉收缩功能下降，诱发子宫内膜炎、胎衣不下、难产、真胃移位等疾病，严重时可导致动物死亡。研究表明，降低饲粮阴阳离子差（dietary cationanion difference, DCAD），可诱发机体轻度代偿性代谢酸中毒，降低体液（尿液、血液）pH，增强机体对钙的吸收，提高血钙水平，是防治低血钙的有效营养措施[3-5]。

动物发生低血钙时，机体通过甲状旁腺素（para⁃thyroid hormone, PTH），1,25-二羟基维生素D3[1,25-(OH)VD3]、降钙素（calcitonin, CT）三大代谢途径调控骨吸收、胃肠道吸收和肾脏重吸收的方式维持血钙稳恒[6]。镁作为体内重要的阳离子，与胞内许多酶活、体液钙、磷等存在一定的互作关系，会通过影响PTH分泌来改变动物的血钙水平。在血钙调节系统中PTH 受体三级结构的改变会导致G-α蛋白复合物依附在细胞中，并使鸟苷二磷酸（guanosine diphosphate,GDP）分子转变成镁-三磷酸鸟苷（Mg-guanosine tri⁃phosphate, Mg-GTP）分子；与此同时，G-α蛋白复合物会转移PTH 受体，形成腺苷酸环化酶（adenylate cy⁃clase, AC），使镁-腺苷三磷酸（Mg-adenosine triphos⁃phate, Mg-ATP）转换为环腺苷酸（cyclic adenosine monophosaphate, cAMP）；cAMP 则采用激活激酶和启动其他酶的方式来共同调控血钙含量使其恢复至正常范围。可见，如果摄入的Mg2+不足，动物体内Mg-GTP和Mg-ATP水平就会下降而诱发低镁血症，机体调节钙的能力减弱，最终引起动物血钙浓度降低。

笔者假设，在低DCAD 条件下提高Mg 水平能促进PTH 分泌，增强机体组织对PTH 的敏感性，协同促进cAMP 生成，降低低血钙的发生率。据此，在已完成低DCAD 对血钙稳恒调控[7]、血钙调控因子浓度[8]、瘤胃发酵参数[9-10]的影响研究后，本试验围绕低DCAD与镁的协同作用，研究两者对血钙及其相关调节因子含量的影响，为防治低血钙提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲养管理

试验采用交叉试验设计，按年龄、体重相一致的原则，将6只黔北麻羊雌羊分为2组：对照组、处理组，每组3 个重复，每个重复1 只羊。对照组饲喂基础饲粮，DCAD值设定为100 mmol/kg（干物质基础）。试验组在基础饲粮中添加阴离子盐（MgCl2·6H2O, 45 g/d）和镁（MgO, 10 g/d），DCAD值设定为-100 mmol/kg（干物质基础）。两组饲粮DCAD 的预设值与实测值稍有偏差，实测值分别为：75、-111 mmol/kg（干物质基础）。试验分2个阶段，共持续30 d。其中一阶段15 d，包括12 d预试期和3 d采样期。前一阶段结束后，对照组和试验组山羊交换饲粮投喂。试验羊进行统一单笼饲养管理，羊舍自然通风，每天9:00和18:00人工定时投喂，自由采食和饮水。山羊试验饲粮组成及营养水平见表1。

表1 山羊饲粮组成及营养水平（干物质基础）

1.2 检测指标

1.2.1 饲粮营养成分

每天采集试羊饲粮样品，待试验期结束后粉碎混匀样品，制备成分析试样检测其常规养分含量。采用内源性指示剂法测定消化率，在采样期连续收集每只羊3 d的粪便样品，取20%的样品加入10% HCl固氮，65 ℃烘干至恒重，测定养分消化率。其中饲粮和粪样的粗蛋白质（CP）含量采用凯氏定氮法（GB/T 6432—1994）测定；中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）含量采用Van Soest 纤维素分析法[11]检测；粗灰分（Ash）含量通过高温灼烧法（GB/T 6438—2007）测定；通过内源指示剂法（GB/T 23742—2009）测定酸不溶灰分（AIA）含量来计算养分消化率。Na、K、Mg的测定选用原子吸收法（热电-3500，美国），Cl、S分别采用AgNO3滴定法（GB/T6439—1992）、Mg(NO3)2法（GB/T 17776—1999）测定。采用Riond[12]提出的公式计算DCAD，计算公式如下：

DCAD=Na（%）/0.002 3+K（%）/0.003 9-Cl（%）/0.003 55-S（%）/0.001 6

1.2.2 尿液pH

大量研究表明，降低DCAD必然会显著降低尿液pH。因此，为减轻工作量，试验只在第一阶段试验期内（1～15 d）每天测定2组试羊尿液pH，记录其变化情况，作为尿液pH 随低DCAD 的变化而变化的情况。检测方法如下：当试羊排尿时，用pH精密试纸（pH范围为5.0～9.0，上海试剂三厂）立即蘸取尿液，与标准比色板比对测定。

1.2.3 血液生化指标

用真空抗凝采血管对试羊颈静脉采血10 mL，4 000 r/min离心15 min（80-2 型离心沉淀机，江苏中大仪器科技有限公司），分离并取上清血浆，用于测定血钙生化指标。血钙生化指标包括Ca2+、Mg2+、甲状旁腺素（PTH）、1,25二羟维生素D3[1,25-(OH)2VD3]，检测试剂盒购自南京建成生物公司。维生素D 受体（vita⁃min D receptor, VDR）、钙结合蛋白（calcium-binding protein-D9k, CaBP-D9k）、细胞膜钙泵（plasma mem⁃brane Ca-ATPase 1b, PMCA1b）试剂盒购自上海蓝基生物有限公司。

1.2.4 瘤胃发酵参数

在试验期每阶段第15 d 晨饲前，经试羊口腔用胃管式瘤胃液采集器抽取50 mL 瘤胃液，立即测定pH，然后经4 层纱布过滤，3 000 r/min 离心15 min（80-2型离心沉淀机，江苏中大仪器科技有限公司），分装上清液，测定瘤胃缓冲力和瘤胃发酵参数：氨态氮浓度（NH3-N）、纤维素酶活性、挥发性脂肪酸（VFA）。pH 用便携式pH 计（梅特勒-托利多仪器FG2-ELK，上海）测定；NH3-N浓度参照冯宗慈等[13]的方法进行测定；纤维素酶活性测定方法按照霍鲜鲜等[14-15]的方法测定；VFA指标参考相关文献[16-18]用气相色谱仪（日本岛津GC-9A）测定。瘤胃缓冲能力（BC）的测定参照Tucker 等[19]提出的缓冲力指数法：取10 mL 瘤胃液用0.1 mol/L HCl 滴定，待pH 降至5，根据耗酸量计算缓冲容量。计算公式为：BC(mL)=0.1 mol/L的HCl(mL)×103/20 (mL)

1.3 数据统计分析

原始数据采用Excel 2010 进行初整理，再使用SAS 9.4 统计处理软件对数据进行分析，试验数据用“平均值±标准差（Mean±SD）”表示，P<0.05 表明各组间存在差异性显著。

2 结果与分析

2.1 尿液pH（见图1）

如图1A 所示，两组山羊尿液pH 在试验开始前3 d 基本一致，随着饲喂时间的延长，试验组山羊尿液pH 显著降低（P<0.05）。在第一阶段试验期内（1～15 d），试验组山羊尿液pH 平均值显著低于对照组（P<0.05），见图1B。

图1 尿液pH

2.2 养分消化率（见表2）

表2 低DCAD补Mg对山羊养分消化率的影响（%）

由表2可知，与对照组相比，试验组DM消化率显著下降（P<0.05），CP、NDF、ADF、Ash消化率差异不显著（P>0.05）。

2.3 血钙生化指标（见表3）

如表3 所示，低DCAD 补Mg 可提高山羊血钙、血镁及其代谢因子活力，试验组血浆Ca2+、Mg2+、1,25-(OH)2VD3、PMCA1b 水平均显著高于对照组（P<0.05）。其余指标差异不显著（P>0.05）。

表3 低DCAD补Mg对山羊血Ca及其代谢因子的影响

2.4 瘤胃发酵参数（见表4）

由表4 可知，两组山羊瘤胃液pH、NH3-N 浓度无显著差异（P>0.05）。对于瘤胃缓冲能力，试验组显著高于对照组36.78%（P<0.05）。试验组纤维二糖酶的活性显著升高（P<0.05）；微晶纤维素酶、羧甲基纤维素酶、木聚糖酶活性差异并不显著（P>0.05）。两组山羊瘤胃乙酸、丙酸、丁酸、A/P、TVFA的测定结果接近，无显著差异（P>0.05）。

表4 低DCAD补Mg对山羊瘤胃发酵参数的影响

3 讨论

3.1 低饲粮阴阳离子差补镁对山羊尿液pH的影响

尿液pH 是用来评价动物体液酸碱平衡的指标，通过监控尿液pH的动态变化可反映出体内酸碱平衡状态的维持情况。依据强离子差理论[20]，Mg2+在机体酸碱平衡调节的过程中发挥着重要作用，影响着体内的矿物质代谢。研究表明，饲粮中添加MgO 可增加Mg2+水平，使动物的尿液pH升高，但增幅不明显[21-22]，Mg 并不是影响机体酸碱平衡的最主要因素[23]。这可能是由于反刍动物消化道吸收并释放阳离子至血液的过程中，相比较而言，Na+、K+的吸收效率大于Mg2+，对尿液pH的影响也较大。可见，本试验中的尿液pH主要由DCAD 水平决定。研究指出，DCAD 和尿液的pH之间存在很强的关联性，DCAD值的降低会引起尿液pH 下降[24-25]。本试验结果显示，与对照组相比，试验组山羊尿液pH显著降低（P<0.05）。这得到前人研究结果的支持[26]。总体而言，随着DCAD水平的降低，尿液pH随之降低。

3.2 低饲粮阴阳离子差补镁对山羊血钙生化指标的影响

动物体内血钙稳恒主要依靠骨钙动员、肾重吸收钙和胃肠道钙吸收来调节。骨钙动员通过持续分泌PTH 来刺激成骨细胞释放破骨细胞激活因子和前列腺素来活跃破骨细胞促进矿化的骨质溶解入血；PTH可上调主细胞上TRPV5、NCX1、CaBP-D28k 表达水平，1,25-(OH)2VD3协同上调CaBP-D28k表达量，来共同加强肾脏重吸收钙的能力[27]；胃肠道对钙的吸收主要受1,25-(OH)2VD3与VDR 表达水平来共同影响，而PTH可通过激活1-α羟化酶的方式来促进25-羟基维生素D二次羟化变成1,25-(OH)VD3，最终使食物混合物中的钙进入血液中被吸收。

Zhang 等[28]指出，血浆镁不足时会引发一系列的生理问题，包括使骨盐的沉积结晶作用加重，生长板中骨盐的含量升高，还会降低磷酸肌醇系统、cAMP的活性，迫使PTH 对骨和肾脏的影响减弱。Matsuzaki等[29]试验发现，减少小鼠饲粮中镁的水平会使维生素D相关代谢酶（1α-羟化酶）含量降低，肾脏中24-羟化酶的表达量会增加，最终引发1,25-(OH)2VD3的合成停滞。本试验采用交叉试验设计，消除了血钙生化指标受山羊间个体差异所造成的影响，结果与对照组相比，试验组血浆Mg2+水平显著升高，提示Mg的吸收效率明显提高。

在胃肠道对钙的吸收过程中，进入小肠后的钙需要TRPV6的作用来进入细胞，之后钙与CaBP-D9k 结合转运至细胞基底膜，最终受PMCA1b 和NCX1 的协同作用进入血液。与对照组相比，本试验的试验组血浆Ca2+、1,25-(OH)2VD3、PMCA1b水平均显著提高。其原因可能是：①低DCAD和MgO都能够促进PTH的分泌，有利于机体生成1,25-(OH)2VD3，最终来提高血钙的水平；②Mg2+作为胃肠道钙吸收因子能够激活细胞膜上的酶，提升血浆PMCA1b水平，将Ca2+外排出胞入血，提高血Ca水平。依据本试验研究结果，当血液中的镁含量过低而引起动物低血钙时，应该在饲粮中有稳定的镁源供应，若不适合可再通过降低饲粮DCAD水平的方式来防治低血钙。

3.3 低饲粮阴阳离子差补镁对山羊瘤胃发酵参数的影响

反刍动物瘤胃pH是反映瘤胃发酵活动正常与否的主要指标之一。饲粮结构和比例的改变、唾液中缓冲盐的分泌量、NH3-N和VFA等发酵产物的含量等均会引起瘤胃液pH 的变化，如果变化幅度太大则有可能会降低微生物活性和数量，尤其是纤维素分解菌。

有关DCAD 水平对瘤胃pH 影响的结论存在差异，但pH都处于正常范围。Apper-Bossard等[30]发现，DCAD 的增加不会对奶牛瘤胃pH 造成显著影响。然而随着DCAD 水平的降低，瘤胃pH 越小，水牛饲喂MC（中阳离子）和HC（高阳离子）饲粮比饲喂A（阴离子）和LC（低阳离子）饲粮的瘤胃pH 要高[31]。Martins等[32]发现，提高泌乳奶牛DCAD会使瘤胃液的pH线性增加，Iwaniuk 等[33]也得出类似结论。本试验中，添加阴离子盐和MgO 不影响山羊瘤胃液的pH，可能是缓冲剂MgO 改善了瘤胃的内环境状态，稳定了瘤胃液pH，具体原因还需要进行更深入的研究。

瘤胃缓冲体系是反刍动物特有的稳定调控系统，在维持酸碱平衡及稳定瘤胃微生态环境方面发挥着重要的作用，常用瘤胃液缓冲力指标来衡量。瘤胃液缓冲力可以维持瘤胃pH 的稳定，可以防止反刍动物酸中毒和保障瘤胃健康与微生物的活性，NH3-N浓度和DCAD 水平的改变均会对瘤胃液缓冲力造成影响。MgO可以改善瘤胃溶液的酸碱缓冲能力，以此来调控瘤胃pH提高饲料的消化和细菌蛋白质的合成能力。本试验结果显示，试验组的瘤胃缓冲能力显著提高，猜测是由于添加MgO增加瘤胃内缓冲体系的缓冲容量效果比添加阴离子盐的作用效果要更强。

NH3-N是饲粮蛋白质被瘤胃微生物降解的产物，同时也是瘤胃微生物合成菌体蛋白的底物[34]。NH3-N浓度受饲粮中氨氮的含量、瘤胃缓冲能力等多种因素的影响。Vagnoni 等[35]研究表明，添加阴离子盐可以提高瘤胃内NH3-N 浓度，原因可能是饲粮中的NPN含量较高。Sharif等[36]研究发现，高DCAD饲粮可以提高瘤胃NH3-N 浓度。饲粮添加阴离子盐降低DCAD的酸化效果对蛋白质在瘤胃内的降解作用没有显著影响，不会影响NH3-N浓度的变化[37-38]。本试验中，两组NH3-N 浓度无显著差异，说明在瘤胃pH 变化不显著时，MgO的添加有助于改善瘤胃液的缓冲能力。

反刍动物消化吸收饲粮中纤维物质主要与瘤胃微生物分泌的纤维素酶（羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶、纤维二糖酶及木聚糖酶）有关[39]。纤维分解菌分泌的多酶复合体是降解纤维素的主要物质，因此纤维素酶的活性常用来衡量瘤胃微生物降解饲粮纤维素的能力。Wang 等[40]研究发现，随着DCAD 的提高，瘤胃内纤维素分解菌的数量显著增加。曹维维[41]指出，瘤胃pH 与饲粮DCAD 水平呈正相关，DCAD 水平的升高会使瘤胃pH提高而影响着瘤胃的内环境，瘤胃液中纤维分解菌则会生长得更好。相反，饲粮中添加阴离子盐过多会抑制纤维分解菌的生长。本试验中与对照组相比，试验组的羧甲基纤维素酶活性、纤维二糖酶活性、木聚糖酶活性均有所升高，但微晶纤维素酶活性没有明显变化。这可能是因为：①反刍动物瘤胃液本身具备一定的缓冲能力，可以降低阴离子盐对瘤胃pH所带来的消极影响；②少量的MgO也能影响瘤胃内环境状态，促进瘤胃内纤维分解菌的增长，提高纤维素酶活性，瘤胃对纤维物质的降解能力增强。

反刍动物瘤胃黏膜内的丰富血管和上皮细胞间的许多裂隙能够供给瘤胃来吸收养分，瘤胃微生物可将碳水化合物分解成乙酸、丙酸及丁酸等VFA。VFA则为反刍动物提供自身所需要的能量，它的浓度及产量影响着养分的消化吸收、利用以及反刍动物生产性能的发挥。Catterton 等[42]研究表明，饲粮添加阳离子（Na+和K+）来提高DCAD不会影响瘤胃pH或TVFA浓度。添加阴离子盐也不会对VFA（乙酸、丙酸、丁酸、A/P、TVFA）产生显著影响[38,43]。以上研究结果表明，DCAD 的改变一般不会对VFA 相关指标造成显著性影响，而MgO 主要是调整瘤胃液pH 来影响瘤胃溶液的酸碱缓冲能力，本试验两组之间瘤胃pH 无显著差异，据此说明阴离子盐和MgO的共同使用不会对VFA相关指标产生显著性影响。