结直肠癌患者血液游离DNA水平与病理特征的关系

鲁振环，张涛，朱晓峰，曾德强

（广东省韶关市粤北人民医院 胃肠外科，广东 韶关 512025）

0 引言

结直肠癌是临床常见恶性肿瘤，流行病学调查显示其发病率和死亡率居恶性肿瘤第四位，且其发病有年轻化趋势[1]。结直肠癌的早期诊断是改善患者预后的关键，游离DNA是由单链和双链DNA组成的无细胞形态的DNA，既往有报道显示肿瘤微转移灶和细胞裂解可增加游离DNA表达量[2-3]，推测游离DNA可能参与结直肠癌变过程，本研究回顾性分析医院60例接受血清循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）检测患者的临床资料，探讨cfDNA与结直肠癌病理特点的关系，为结直肠癌的早期诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料。本研究经我院伦理委员会批准，采用简单随机抽样法选取医院2018年9月至2019年9月60例接受cfDNA检测的患者作为研究对象，对其临床资料进行回顾性分析。其中30例经病理活检确诊为结直肠癌[4]，为观察组，其中男18例，女12例；年龄（49.62±9.05）岁；体重指数（20.79±2.31）kg/m2。另30例为结肠息肉患者，为对照组，其中男21例，女9例；年龄（47.91±8.65）岁；体重指数（20.55±2.08）kg/m2。两组患者性别、年龄、体重指数等基本资料无显著性差异（P＞0.05），具有可比性。

1.2 实验试剂和方法。在患者入院后24 h内空腹采集肘静脉血5 mL，3000 r/min离心10 min，留取血清于EP管内，-700C冻存备用。选用Qiagen公司生产的DNA提取试剂盒，游离DNA提取方法参照试剂盒说明进行。利用 Invitrogen 公司生产的 Sybr Green 定量 PCR 预混液进行。利用分子生物学软件DNAStar对GenBank中登录的PPIA基因序列进行分析，再用PrimerSelect软件在基因保守区域设计检测引物，并对引物进行二聚体和发夹结构等分析，筛选出2对引物，序列分别为PPIA-116F：AAG AAG TGA CTG CTC ATC TA，PPIA-116R：AAG CAC TGC TGCACG ATC A；PPIA-132F：ACA TGG GTA CTA AGC AAC AAA ATA AG；PPIA-132R：CAC AAT TGG AAC ATC TTT GTT AAA C，合成PPIA基因片段。25 ul总反应体系中包含 12.5ul 2 X预混反应液，正反向引物（10uM）各 1ul，DNA 5ul，双蒸水5.5 ul，反应条件为95°10 min，40个循环的95°15 s-60度1 min，在60°收集荧光信号，采用荧光定量PCR仪测量Ct值，利用灭菌纯水提取质粒DNA，稀释后取5个梯度标准品，以荧光定量PCR作标准曲线，根据公式计算样本中cfDNA浓度。cfDNA浓度=标准曲线确定样品拷贝数/反应中血浆体积。

1.3 观察指标。比较不同性别、年龄、体重指数、肿瘤分类、分期及肿瘤直径患者cfDNA浓度。采用受试者工作曲线（receiver operating characteristic，ROC）分析cfDNA浓度判断结直肠癌的价值，结果以曲线下面积（area under the curve，AUC）表示，以AUC＞0.75为应用价值高。

1.4 统计学方法。选用SPSS 22.0软件包处理数据，计量资料以均数±标准差表示，两两比较行t检验，计数资料以百分比表示，两两比较行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组cfDNA浓度比较。观察组患者cfDNA浓度为（413.16±104.43）ng/ mL，对照组为（276.33±97.46）ng/mL，两组cfDNA浓度比较，差异有统计学意义（t=5.247，P=0.001）。

2.2 不同特征结直肠癌患者cfDNA浓度比较。不同肿瘤直径患者cfDNA浓度差异有统计学意义（P＜0.05），不同性别、年龄、体重指数、肿瘤分类及分期的结直肠癌患者cfDNA浓度比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）.见表1。

表1 不同特征结直肠癌患者cfDNA浓度比较

2.3 cfDNA浓度判断结直肠癌的价值分析。以cfDNA浓度为检验变量，以是否为结直肠癌为状态变量，绘制ROC曲线。见图1，结果显示其AUC为0.759（S.E.=0.062，95%CL=0.638-0.881，P=0.001）。灵敏度为0.867，特异度为0.567，最佳截断值为373.50 ng/mL。

图1 cfDNA浓度判断结直肠癌的ROC分析

3 讨论

结直肠癌的早期诊断对提高临床治疗效果和改善患者预后具有重要意义，而肿瘤标记物作为非损伤性实验室指标，被公认为是结直肠癌早期筛查的重要依据[5]。近年来有学者发现外周血血清中存在来源于肿瘤细胞微转移灶的特异性DNA[6]，这可能有助于结直肠癌的早期诊断。本研究发现结直肠良恶性患者间cfDNA水平差异显著，提示cfDNA浓度可作为诊断结直肠癌的依据之一，Rui Zhang等[7]还认为血清cfDNA浓度与结肠早期病变程度具有显著相关性。而分子实验则发现随着肿瘤进展，肿瘤细胞被巨噬细胞吞噬，使cfDNA浓度逐渐增加[8-10]。因而，cfDNA浓度检测有望成为早期诊断结直肠癌的无创指标。

本研究还发现不同肿瘤直径患者cfDNA浓度差异显著，这可能是因随着肿瘤生长，更多的cfDNA被释放入血所致。Barault L等还认为cfDNA浓度与肿瘤负荷相关，也说明cfDNA参与肿瘤增殖生长。本研究采用ROC分析显示cfDNA判断结直肠癌的AUC为0.759，提示cfDNA有助于结直肠癌的早期诊断。另外，李禹龙等报道还发现不同cfDNA浓度患者总生存期差异显著，提示监测cfDNA浓度有助于预后判断，cfDNA浓度可能与结直肠癌的恶性程度相关，但其具体原因还有待进一步研究。本研究随访时间较短，未行不同cfDNA浓度患者预后比较，这有待今后延长随访时间观察。

综上所述，不同结直肠癌肿瘤直径患者cfDNA浓度差异显著，检测cfDNA浓度有助于结直肠癌的早期诊断。