HF-09菌株降解烟梗纤维素及其休止细胞发酵产香效果

吴长伟，弓新国，郑 琳，张 勃，蒋美红，李学杉，黄志强，普兴伟，吴明美，李 仙

(常德华馥生物技术有限公司，湖南 常德 415900)

烟草提取物含有烟草特征香味物质，相比于其他来源的提取物，易与卷烟协调一致，是重要的烟用添加剂，广泛应用于卷烟工业[1-4]。目前，烟草提取物大多采用溶剂浸提法制得[5-7]，方法相对单一，所富集的致香物质组成复杂，目标性不强。微生物发酵产香技术已被研究和广泛应用[8]。目前，大多研究将产香微生物直接接种到物料中进行生物发酵产香，但该方法的生物代谢途径相对复杂，发酵过程不易控制，致香物质转化率不高[9-10]。而微生物休止细胞发酵技术具有反应专一性强、底物转化率高、不易染杂菌、产物对菌体生长抑制作用较小等特点，发酵产物得率高，可以部分实现物质的定向转化，且发酵过程易于控制[11-14]。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)是芽孢杆菌属的一个新种，在农业生产上具有促进植物生长和抵御病原微生物的作用[15-18]。据报道，该菌具有降解木质纤维素的能力。陈龙[19]从杜仲树皮内分离得到一株芽孢杆菌157，经16S rRNA分子生物学鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis157)，利用其对秸秆和豆粕混合物进行固态发酵，纤维素降解率为9.06%，半纤维素降解率为43.61%。但利用贝莱斯芽孢杆菌休止细胞发酵法降解烟草木质纤维素产香的研究少见报道。为此，以筛选的降解烟草木质纤维素贝莱斯芽孢杆菌(BacillusvelezensisHF-09)为出发菌株，研究其降解烟梗木质纤维素转糖能力及休止细胞发酵定向转化致香成分的特点，以改善烟梗浸膏的感官抽吸品质。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂

材料：烟梗样品来源于云南昆明红云红河集团，品种等级为红大(C3F)；降解烟草木质纤维素细菌贝莱斯芽孢杆菌HF-09(BacillusvelezensisHF-09)，分离自云南省昆明市烟草栽培土壤。

试剂：葡萄糖(AR，广东汕头市西陇化工厂)、氯化钾(AR，天津市博迪化工有限公司)、牛肉膏(BR，北京奥博星生物技术责任有限公司)、蛋白胨(BR，上海中科昆虫生物技术开发有限公司)、无水Na3PO4(AR，广东汕头市西陇化工厂)、无水硫酸钠(AR，广东汕头市西陇化工厂)、二氯甲烷(AR，天津市博迪化工有限公司)。

1.2 仪器设备

XP404S型电子天平(感量：0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司)、KDM型调温电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)、UV-9100型紫外-可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)、SKY-211B大容量恒温培养摇床(上海苏坤实业有限公司)、R-3000型旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)、同时蒸馏提取器(上海楚柏实验室设备有限公司)、6890N/5973N气相色谱/质谱联用仪(GC/MS，美国Agilent公司)、Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株HF-09的生长条件检测 生长曲线：将纯化后的菌株HF-09过夜培养后，菌落计数，调整菌液浓度并测定其OD600值，再按照1%接菌量转接至100 mL液体LB培养基中，测定菌液起始OD600值，于180 r/min摇床37 ℃培养，每间隔1 h取样，重复测定OD6003次，绘制生长曲线。

耐受试验：①温度耐受：将纯化后的菌株HF-09培养于正常LB液体培养基，37 ℃、180 r/min摇床培养12 h后，75 ℃水浴20 min，即芽孢体，洗涤3次后将1 mL菌液分装到EP管中，分别置于不同温度水浴处理20 min后，立刻冷却至常温；②pH值耐受：按照上述方法制备菌株HF-09芽孢体，随后将1 mL菌液分装到EP管中，分别接种到pH值2～12的不同缓冲液中，37 ℃处理3 h。上述耐受试验均采用倍比稀释后平板计数，用37 ℃的菌液做空白对照。存活率=(处理后的细菌数/处理前的细菌数)×100%[19]。

1.3.2 烟梗木质纤维素含量检测 将烟梗经菌株HF-09固态发酵10 d的降解产物送至云南同创检测技术有限公司进行检测。采用聚酯纤维滤网袋法测定纤维素、半纤维素、木质素的含量，计算其降解率(DR)。DR=(接种前某成分含量-接种后某成分含量)/接种前某成分含量×100%[20]。

1.3.3 休止细胞制备 将菌株HF-09接种到液体LB培养基中，37 ℃下振荡培养约18 h至光密度值达2.0。菌液于8 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，收集菌体，然后用50 mmol/L的磷酸钠缓冲液(pH值为7.0)洗涤3次。菌体于100 mL50 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH值为7.0)中重悬，此悬浮细胞即为菌株HF-09的休止细胞。

1.3.4 菌株HF-09休止细胞液体发酵制备烟梗浸膏 将烟梗粉碎成粉，水回流提1 h，自然冷却后均按1%的接种量加入菌株HF-09发酵液和菌株HF-09休止细胞，OD600均为2.0，37 ℃恒温发酵12 h。发酵液于100 ℃条件下灭活处理10 min，过滤，滤出液减压浓缩至膏状，分别制得菌株HF-09发酵烟梗浸膏和菌株HF-09休止细胞发酵梗膏。未发酵烟梗直接提取，过滤，滤出液减压浓缩至膏状。

1.3.5 烟梗浸膏理化性质检测 按照烟草行标YC/T 145.1—145.9对烟梗浸膏的外观、澄清度、相对密度、酸值、挥发性成分总量等进行测定；按照GB/T 5009.75—2003《食品添加剂中铅的测定》和GB/T 5009.76—2003《食品添加剂中砷的测定》的方法测定重金属元素铅(Pb)和砷(As)的含量。

1.3.6 烟梗浸膏常规成分GC-MS分析 将烟梗浸膏25 g放入同时蒸馏萃取装置一端的圆底烧瓶中，加入250 mL蒸馏水，装置的另一端盛有25 mL二氯甲烷，在60 ℃下水浴加热，同时蒸馏萃取3 h。二氯甲烷萃取液用无水硫酸钠干燥，置于4 ℃下过夜，过滤，将滤液倒入浓缩瓶中用Vigreux柱浓缩至约1 mL。选择萘为内标物，每1 mL浓缩液中加入含50 μL萘(0.1 mol/L)的无水乙醇溶液，摇匀后，用于GC-MS分析。

气相色谱条件：毛细管柱HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样温度240 ℃，载气He，流速1.0 mL/min，分流比25∶1，进样量2 μL，升温程序为起始温度50 ℃保持1 min，以10 ℃/min上升到260 ℃后保持5 min，GC-MS接口温度280 ℃。

质谱条件：EI方式，离子源温度230 ℃，离子化电压70 eV，扫描范围35～455 amu，扫描速率1.65 scan/s。

1.3.7 烟梗浸膏应用及感官评吸 分别配制质量浓度10、15、20 mg/mL的3种烟梗浸膏水溶液，取2 mL喷洒于100 g红大烟丝(X3L)上，装入PVC 塑料袋密封，置于25 ℃样品平衡箱中保存8 h；每20支烟支质量(18.0±0.25)g；将烟支于温度22 ℃和相对湿度60%的恒温恒湿箱中平衡48 h。由7人组成的专业评吸小组根据GB/T 5606.4—2005标准进行评吸，对添加效果进行感官质量评价。

2 结果与分析

2.1 菌株HF-09的生长曲线及耐受性

菌株HF-09在LB液体培养基中的生长曲线表明(图1)，培养时间0～7 h为迟缓期，7～20 h达到对数期，生长速度较快。该菌在pH值 5～9下的存活率均在94%以上；在75 ℃以下的存活率在92%以上。良好的pH值和温度耐受性可能与其形成芽孢的能力密切相关。

2.2 菌株HF-09降解纤维素转糖试验

采用菌株HF-09对红大烟梗固体发酵10 d，并对木质纤维素降解后转糖能力(图2)进行检测，结果显示，纤维素和半纤维素含量均有明显降低，总糖和还原糖含量上升。纤维素含量由12.70%降低到10.29%(降解率18.98%)；半纤维素含量由7.52%降到5.24%(降解率30.32%)；总糖含量由26.63%增到31.98%(提升率20.10%)；还原糖含量由21.93%增到26.62%(提升率21.39%)。其中，烟草还原糖对烟气的香吃味有良好的作用，并能减少烟气的刺激性，对烟叶品质影响较大，是决定烟叶品质的重要化学成分[20-23]。

2.3 休止细胞发酵烟梗制备浸膏中的组分分析

2.3.1 烟梗浸膏组分的理化指标 将烟梗粉碎(小于630 μm)，采用直接提取、常规发酵和休止细胞发酵3种工艺制备烟梗浸膏，理化指标检测结果(表1)显示，3种烟梗浸膏各种理化性质正常，重金属含量也符合行业要求。发酵后的烟梗浸膏酸值明显提升，尤其是采用休止细胞发酵后酸值较未发酵提升57.69%，菌株HF-09降解烟草木质纤维素成糖的同时，也可能伴随着酸性物质的生成。

表1 不同工艺烟梗浸膏的理化指标检测结果

3种烟梗浸膏的常规化学指标(图3)检测结果表明，经菌株HF-09常规发酵和休止细胞发酵处理后，烟梗浸膏中的总糖、还原糖含量均有所提升，总糖含量由16.85%分别提升到18.30%和24.80%(提升率8.61%和47.18%)，还原糖含量由16.21%分别提升到17.20%和22.50%(提升率6.11%和38.80%)。同时，休止细胞发酵处理后，总氮、氯离子含量均有所下降，总氮含量由1.12%下降到0.96%(下降率14.29%)，氯离子含量由0.92%下降到0.70%(下降率23.91%)，钾离子、总植物碱含量没有明显变化。烟草中的氯离子往往会降低卷烟吃味，增加刺激，与烟草品质呈负相关[24-26]。休止细胞发酵较常规发酵具有更为显著的提高总糖、还原糖含量，降低氯离子、总氮含量的工艺优势。

2.3.2 烟梗浸膏中主要致香成分 对不同工艺制备的烟梗浸膏中27种主要致香成分含量分析结果(表2)显示，与未发酵烟梗浸膏相比，常规发酵和休止细胞发酵烟膏27种主要致香成分含量有较大变化。从致香物质总量来看，常规发酵烟梗浸膏27种主要致香物质含量由89.033 μg/g略降到85.240 μg/g，休止细胞发酵烟梗浸膏27种主要致香物质含量反而增加到109.590 μg/g，增长幅度为23.09%。从致香物质变化情况来看，常规发酵烟梗浸膏和休止细胞发酵烟梗浸膏相对于未发酵烟梗浸膏分别有11种和9种致香物质含量降低，16种和18种致香物质含量增加，但变化的致香成分品种略有不同。在2种发酵烟梗中含量均下降的致香物质有7种，含量均增加的致香物质有14种。

表2 不同工艺烟梗浸膏主要致香成分的GC-MS分析

续表2 不同工艺烟梗浸膏主要致香成分的GC-MS分析

2.3.3 不同工艺烟梗浸膏中主要致香成分含量比较 单一致香成分绝对含量对比分析(图4)结果显示，菌株HF-09以2种发酵工艺处理后苯甲醇、胡薄荷酮、茄酮、巨豆三烯酮、3-氧代-α-紫罗兰醇、肉豆蔻酸、十五酸、金合欢基丙酮、棕榈酸甲酯、十六酸等致香成分含量均有明显提升，多为酮类、醇类和大分子脂肪酸类。酮类和醇类物质具有丰富烟草本香，提升质感的作用；大分子脂肪酸具有柔顺烟气，改善卷烟吃味的作用[27-28]。同时，糠醛、2-环戊烯-1,4-二酮、苯乙醛、吲哚、二氢猕猴桃内酯、新植二烯等致香成分含量均略有下降。其中，新植二烯作为烟草中含量最高的潜香物质，本身不具香气，但其降解产物对烟草香气有重要贡献[29]。另外，该结果也表明菌株HF-09不但具有高效降解烟梗木质纤维素转糖的能力，还可能有降解烟草中大分子物质(还原糖、长链烯烃等)生成致香物质的潜在能力，且休止细胞发酵工艺较常规发酵有更加高效的转化及生香效率。

2.3.4 菌株HF-09生成主要致香成分的转化特点 分析降解烟梗木质纤维素菌株HF-09对烟梗浸膏主要致香成分的转化特点(图5)，分别计算出常规发酵样品和休止细胞发酵样品相对于未发酵样品的27种致香成分变化，结果表明，从致香成分相对含量变化趋势来看，除苯甲醛、芳樟醇、藏花醛等物质外，2种发酵工艺下致香成分相对含量的变化趋势基本一致，推测休止细胞发酵工艺并没有改变原有的代谢路径。从致香成分相对含量变化幅度来看，菌株HF-09降解烟梗纤维素物质转化成长链脂肪酸及脂肪酸酯的能力较强，能显著提升肉豆蔻酸、十五酸、十六酸、棕榈酸甲酯等烟草重要物质的含量，该类物质在卷烟中具有调节烟气形态、柔顺烟气、改善吃味及舒适性的作用[30]。从2种发酵工艺转化效率来看，休止细胞发酵转化效率更高，更具有代谢专一性，比常规发酵更具有转化优势，休止细胞发酵产生的肉豆蔻酸、十五酸、十六酸、棕榈酸甲酯的含量分别比未发酵工艺提升442.64%、248.40%、165.50%、153.64%，而常规发酵只提升64.72%、73.31%、24.87%、49.56%。

2.4 烟梗浸膏的卷烟加香效果

烟梗浸膏在烟丝添加后的感官评价结果(表3)显示，添加休止细胞发酵烟梗浸膏和常规发酵烟梗浸膏感官抽吸品质均好于添加未发酵烟梗浸膏，添加休止细胞发酵烟梗浸膏综合抽吸品质最好。添加常规发酵烟梗浸膏的试验卷烟样品在甜润感、丰富性和饱满度上有明显改善，但略有刺激。添加休止细胞发酵烟梗浸膏的卷烟样品在烟气丰富性、饱满度、醇和性、细腻感、柔顺感和明亮度上改善较为明显。不同添加量比较表明，常规发酵烟梗浸膏按烟丝质量的0.04%添加量时效果最好，醇和性、明亮度、甜润感、饱满度得到明显改善；休止细胞发酵烟梗浸膏按0.02%添加量时，甜润感、醇和性、细腻感、质感明显提升。

表3 3种工艺烟梗浸膏添加后感官评吸结果

3 结论与讨论

研究了降解烟梗纤维素细菌菌株HF-09的生长曲线、耐受性及转糖效率，利用其休止细胞和常规细胞对烟梗进行液体发酵生香，考察了休止细胞发酵烟梗浸膏、常规发酵烟梗浸膏及未发酵烟梗浸膏的成分差别、变化规律、转化特点及感官品质。①菌株HF-09培养7～20 h为对数期，生长速度较快且具有良好的pH值和温度耐受性，这可能与其形成芽孢的能力密切相关。对红大烟梗固体发酵10 d后，纤维素和半纤维素含量均明显降低，总糖和还原糖含量上升。该菌株具有以烟梗为固体发酵底物，在温和条件下高效降解纤维素转化生糖的能力，在烟草废弃物资源开发利用方面具有极大的潜力。②从烟梗浸膏中的组分来看，相对于未发酵烟梗浸膏，采用菌株HF-09发酵处理后，发酵烟梗浸膏的酸值、总糖和还原糖含量均有所提升。分析27种主要致香成分后发现，2种发酵烟梗浸膏中含量均下降的致香物质有7种，多为潜香物质和长链烯烃类物质，含量均增加的致香物质14种，多为酮类、醇类和大分子脂肪酸类。表明菌株HF-09降解烟梗纤维素物质转化长链脂肪酸及脂肪酸酯的能力强，能显著提升肉豆蔻酸、十五酸、十六酸、棕榈酸甲酯等烟草重要致香物质的含量。③从2种发酵工艺转化效率和烟梗浸膏品质来看，菌株HF-09经2种不同发酵工艺的致香物质代谢途径基本一致，但休止细胞发酵更能显著提高总糖、还原糖、酮类、醇类和大分子脂肪酸类的含量，转化效率和生香率更高，更具有代谢专一性，且感官抽吸品质整体表现较好。可见，休止细胞发酵比常规发酵和未发酵更具工艺优势，具有潜在的应用前景。