MeJA对连翘叶片光合作用及次生代谢的影响

陶 娟，宋小锋，周圆圆

(1.新乡医学院三全学院 生命科学技术学院，河南 新乡 453003； 2.河南中医药大学 药学院，河南 郑州 450046)

连翘[Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl]是木樨科连翘属植物，以种子入药，具有清热、解毒、散结、消肿的功效。现代研究表明，连翘叶中含有连翘酯苷、木脂素类、芦丁和槲皮素等黄酮类、挥发油类、有机酸类化学成分[1]，具备抗菌、抗氧化、抗炎、降血糖血脂等功效[2]，在功能性食品及药品开发方面具有较大开发潜力。民间有用连翘叶制作保健茶饮的传统[3]。连翘资源丰富，广泛分布在山西、河南、河北等地，药材以野生采集为主，生产中常会受到低温、干旱等胁迫[4]，造成产量和品质下降以及次生代谢成分的不稳定。连翘中木脂素类、黄酮类等次生代谢产物是连翘药材的重要有效成分。前人研究表明，茉莉酸甲酯(MeJA)等外源物质可作为一种外源诱导因子促进药用植物体内次生代谢产物的积累[5-7]。目前，关于连翘的研究主要集中在其化学成分及提取[8-10]、药理活性[2,11]、种质资源[12]、栽培技术[4,13]等方面，而外源物质对其光合作用和次生代谢产物的影响研究还未见报道。鉴于此，对连翘叶片喷施不同浓度MeJA，分析其对连翘叶光合作用、叶绿素和总黄酮含量、连翘苷和连翘酯苷A积累以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响，为连翘野生抚育实践中应用外源物质提高连翘品质与产量提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料：连翘栽培于新乡医学院三全学院校园，经卢龙斗教授鉴定为连翘[Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl]，以生长环境一致、生长状况良好的连翘为试验材料。

供试仪器：Li-6400XT便携式光合作用仪(美国Li-COR公司)、SPAD-502Plus叶绿素测定仪(日本柯尼卡美能达控股公司)、A5双光束紫外可见分光光度计(翱艺仪器上海有限公司)。

供试试剂：茉莉酸甲酯(北京索莱宝科技有限公司，纯度≥95%，批号：20180118)、连翘苷标准品(四川维克奇生物科技有限公司，纯度≥95%，批号：150602)、连翘酯苷A标准品(四川维克奇生物科技有限公司，纯度≥95%，批号：150716)、芦丁标准品(四川维克奇生物科技有限公司，纯度≥95%，批号：20030203)、PAL测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 试验设计

在连翘展叶后期，选择生长环境一致、生长状况良好的连翘植株挂签标识，于晴天9:00，采取叶面喷施的方式，分别喷施1 mmol/L(T1)、0.1 mmol/L(T2)、0.01 mmol/L(T3)MeJA，对照(CK)喷施清水，每个处理选取同一高度、生长状况一致的连翘喷施10株，每株喷施至表面叶片湿润且无大液珠流下，喷施前后2 d内晴朗无降雨。

1.3 项目测定

1.3.1 光合特性 在阳光充足时，采用Li-6400XT便携式光合作用仪加红蓝光源，设定光强为1 200 lx，分别于喷施后2、6、24、48、72 h测定样品区连翘叶的光合特性。为保证样品一致性，均选择连翘中上部叶片进行测定，记录净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)、气孔导度(Gs)，重复测定10株。

1.3.2 SPAD 分别于喷施后2、6、24、48、72 h，选取每个处理10株连翘的中上部叶片，采用柯尼卡SPAD-502Plus手持便携式叶绿素仪测定连翘叶SPAD值，注意避开损伤的叶片。

1.3.3 PAL活性 分别于喷施后2、6、24、48、72 h，随机选取每个处理连翘中上部叶片，用锡纸包裹后迅速投入液氮中，冻存于-80 ℃超低温冰箱备用。取0.2 g冻样，放入研钵(预冷)中，液氮下研磨成粉，装入10 mL离心管中，加入2 mL硼酸缓冲液(含0.1%巯基乙醇、2%聚乙烯吡咯烷酮，pH值8.8)，15 000 r/min、4 ℃离心25 min，上清液即为测定所需的酶液。加入10 mmol/L L-苯丙氨酸1 900 μL，酶液100 μL，总体积2 000 μL，混合后，暗反应30 min。反应结束后加入100 μL 5 mol/L盐酸终止反应，290 nm波长下测定吸光值。用硼酸缓冲液(pH值8.8)作为空白参比，重复测定3次。

1.3.4 总黄酮含量 以芦丁为标准品，采用紫外分光光度法测定不同处理连翘叶总黄酮含量。准确称取芦丁标准品0.009 92 g，用少量40%乙醇溶解后，转移入50 mL容量瓶中，40%乙醇定容，摇匀，即为0.198 4 g/L 芦丁标准品溶液。准确移取 1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、4.5、5.5 mL标准品溶液于10 mL容量瓶中，加40%乙醇定容至刻度线处，摇匀，分别从中吸取3 mL溶液，先加0.3 mL 50 mg/mL NaNO2溶液，摇匀，放置6 min；再加0.3 mL 100 mg/mL Al(NO3)3溶液，摇匀，放置6 min；再加2 mL 40 mg/mL NaOH，摇匀，放置15 min。在510 nm下测定并记录其吸光值。利用Excel软件，以质量浓度(mg/mL)为横坐标，吸光值为纵坐标绘图，得出线性回归方程为Y=0.924 6X-0.021 4，R2=0.999 3。

分别于喷施2、6、24、48、72 h，随机选取每个处理连翘中上部叶片，重复3次，于烘箱中60 ℃烘干，研磨成粉。准确称取1.000 0 g连翘叶样品粉末于具塞锥形瓶中，加入40 mL 40%乙醇超声提取，过滤后转入50 mL容量瓶中，40%乙醇定容，摇匀即得供试品溶液。测定方法同上，重复测定3次，并由线性回归方程计算样品中的总黄酮含量。

1.3.5 连翘苷含量 精密称取连翘苷标准品，加甲醇制成每1 mL含0.222 mg的标准品溶液。采用高效液相色谱法精密进样1、3、5、7、10、14 μL，以标准品溶液的峰面积为纵坐标，进样量为横坐标制作标准曲线，得出标准曲线方程为Y=611.52X-2.814，R2=0.999 9。

精密称定1.3.4中各处理连翘叶样品粉末1 g，加入15 mL甲醇，称质量后浸渍过夜，超声处理25 min，放冷后补足质量，过滤，取5 mL滤液于蒸发皿中，水浴锅上挥干甲醇。再以50%甲醇提取，定容至5 mL容量瓶中，过0.22 μm有机滤膜，取过滤液保存于进样小瓶中。以乙腈∶水(25∶75)为流动相，设置流速为1.0 mL/min，柱温为32 ℃，检测波长277 nm。根据标准曲线方程计算样品中连翘苷含量。

1.3.6 连翘酯苷A含量 精密称取连翘酯苷A标准品，加甲醇制成1.612 mg/mL的标准品溶液。采用高效液相色谱法精密进样1、2、3、5、6 μL，以标准品溶液的峰面积为纵坐标，进样量为横坐标制作标准曲线，得出标准曲线方程为Y=656.27X-13.823，R2=0.998 9。精密称定1.3.4中各处理连翘叶样品粉末0.5 g，加入70%甲醇15 mL，将具塞锥形瓶瓶口处用封口膜密封，称定质量，超声处理30 min，放冷后70%甲醇补足减失的质量。摇匀后用滤纸过滤，取滤液过0.22 μm有机滤膜保存于色谱进样瓶中。以乙腈∶0.4%冰醋酸(15∶85)为流动相，设置流速为1.0 mL/min，柱温为32 ℃，检测波长330 nm。根据标准曲线方程计算样品中连翘酯苷A含量。

1.4 数据分析

使用SPSS 17.0软件进行数据分析，采用单因素方差分析中LSD法进行差异显著性分析，P<0.05时存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 MeJA对连翘光合特性的影响

由图1可见，MeJA喷施后2、24、48、72 h，T1—T3处理连翘叶Pn均高于CK。其中，喷施后72 h，T3处理Pn较CK提高50.99%。喷施后2、6 h，T1—T3处理连翘叶Ci均较CK增加；喷施后48 h，均较CK有所下降；喷施后72 h均较CK增加，其中T1、T3处理分别较CK显著增加42.82%、44.69%。整体上看，高浓度MeJA喷施处理(T1)对连翘叶Gs和Tr表现出一定的抑制作用，T1—T3处理Gs和Tr随喷施处理后时间延长总体上表现为先上升后下降的趋势。喷施MeJA 后2、6、24 h，T2和T3处理均提高了Gs，尤其是T2处理增幅最大，分别增加了40.00%、94.44%、130.95%；喷施MeJA后48、72 h，T1—T3处理Gs和Tr均较CK有所下降。

不同小写字母表示同一时间不同处理差异显著(P<0.05)

2.2 MeJA对连翘叶SPAD的影响

由表1可见，喷施MeJA后，连翘叶SPAD值变化不明显。喷施后2 h，T1—T3处理SPAD值下降；喷施后6、24、48 h，各处理SPAD值差异均不显著；喷施后72 h，T1—T3处理均较CK提高，分别增加了6.18%、12.75、7.00%。

表1 MeJA对连翘叶片SPAD值的影响

2.3 MeJA对连翘叶总黄酮含量的影响

由表2可见，T1—T3处理连翘叶总黄酮含量均高于CK，说明喷施不同浓度外源MeJA均能够诱导连翘叶中黄酮类物质的积累。T3处理连翘叶中黄酮类物质含量增加比较显著，喷施后2、6、24、48、72 h分别较CK增加了18.70%、34.13%、30.16%、40.57%、11.02%，喷施后48 h总黄酮含量为15.21 mg/g，为所有处理连翘叶总黄酮含量的最高值。

表2 MeJA对连翘叶片总黄酮含量的影响

2.4 MeJA对连翘叶连翘苷、连翘酯苷A含量的影响

由图2A可知，外源喷施不同浓度MeJA对连翘叶中连翘苷积累影响不同。喷施后24 h，T1—T3处理连翘苷含量均较CK下降，其他时间大都表现出低浓度MeJA(T3处理)诱导合成的效应。T1处理对连翘叶中连翘苷合成表现出一定的抑制作用，而T3处理连翘苷含量则在整体上有一定的提升。从图2B可以看出，外源喷施MeJA对连翘酯苷A积累整体上呈抑制作用，仅在喷施后48 h，T1—T3处理连翘酯苷A含量高于CK，且不存在浓度效应。

图2 MeJA对连翘叶连翘苷、连翘酯苷A含量的影响

2.5 MeJA对连翘叶PAL活性的影响

由表3可见，喷施MeJA后2、6 h，T1—T3处理连翘叶PAL活性均高于CK。喷施MeJA 后2 h，T3处理PAL活性最高，达到150.82 U/g，比对照增加11.95%；而喷施MeJA后6 h，T1处理PAL活性最高，达到150.74 U/g，比对照增加9.24%。随着时间延长，喷施24 h后，T1—T3处理连翘叶PAL活性呈受抑制现象，PAL活性急剧下降，特别是喷施后48 h，T1—T3处理较CK分别降低15.88%、12.38%、12.56%。

表3 MeJA对连翘叶PAL活性的影响

3 结论与讨论

MeJA是一种植物生长发育调节剂，其可通过调节气孔开闭、叶绿素合成代谢等环节来参与植物的光合作用，不同浓度外源MeJA对不同植物光合作用的影响不尽相同[14]。赵许朋等[15]使用0.1～0.75 mmol/L外源MeJA处理头花蓼幼苗，结果发现，其Pn、Gs、Tr和Ci均呈低浓度诱导高浓度抑制的效应。王春丽等[16]使用0.2 mmol/L MeJA处理丹参叶片后，Pn显著降低。本研究发现，不同浓度MeJA及不同处理时间对连翘叶Pn、Ci、Gs和Tr的影响不同，在一定时间内对Gs和Tr表现出低促高抑的作用。FARGUHAR等[17]研究显示，当Pn与Ci呈正相关时，Pn由Gs决定。本研究结果显示，喷施MeJA处理后，Ci变化趋势与Pn变化趋势不同，喷施外源物质MeJA并不会因为影响Gs而影响连翘叶Pn的变化。喷施外源MeJA对连翘叶片Pn和SPAD值表现出明显的促进作用，推测可能是MeJA诱导了连翘叶片叶绿素的积累，进而提高了Pn，增强了光合能力。

MeJA可作为信号分子引起植物发生防御反应，诱导植物体内抗逆相关基因的表达，促使黄酮、萜类、酚酸类等次生代谢物积累[18]。MeJA处理可大幅提高远志、艾纳香等的总黄酮含量[5,19]。本研究发现，外源MeJA能够诱导连翘叶中总黄酮和木脂素类成分(连翘苷)的积累，对苯乙醇苷类成分(连翘酯苷A)的积累则呈抑制作用。这可能是由于连翘苷和连翘酯苷A具有部分共同的前体，外源喷施MeJA可激活其共同前体物质和下游连翘苷生物合成途径中某些酶的活性，造成前体物质和连翘苷合成的积累，而由于共同前体物质被连翘苷合成所利用，从而引起连翘酯苷A合成的抑制。

PAL是苯丙烷类代谢途径的第一个关键限速酶，它可以催化L-苯丙氨酸转化成中间产物(反式肉桂酸、阿魏酸)等，进一步转化为黄酮类、植保素、木脂素等次生代谢产物[20]，PAL的表达量可以间接影响总黄酮等次生代谢产物的含量。罗才林等[21]发现，在MeJA处理下，白及PAL活性显著增加。马海霞等[22]发现，MeJA能够显著增强橡胶草的PAL活性。本研究发现，喷施MeJA后2、6 h，连翘叶PAL活性均高于CK，但随着喷施后时间延长，PAL活性下降。虽然PAL活性降低，但总黄酮和其他次生代谢产物含量并没有明显下降，可能是总黄酮和其他次生代谢产物含量与PAL活性相比存在一个相对滞后期。

综上所述，喷施不同浓度MeJA及喷施后不同时间对连翘叶Pn、Ci、Gs和Tr的影响不同，对连翘叶中总黄酮、连翘苷及连翘酯苷A积累的影响也不同，0.01 mmol/L MeJA喷施后48 h，连翘叶黄酮及连翘苷含量均达到最高，且连翘酯苷A含量也较对照显著提高。