槟榔黄化植原体在叶片中周年消长规律探究

车海彦 曹学仁 林雅婷 罗大全

(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 海南海口571101)

槟榔病理性黄化病是一种由植原体引起的病害，在生产上的危害日益严重，危害面积逐年扩大，已成为海南槟榔种植业发展的限制因素之一。国内外研究者在槟榔病理性黄化病病原鉴定、检测、传播媒介和防控等方面做了许多工作［1-10］，但尚缺乏槟榔黄化植原体在叶片中的周年消长规律研究。本研究采取定点定株取样方式，采用巢式PCR方法，研究季节变化与槟榔黄化植原体在叶片中消长的关系，同时分析黄化病田间症状随季节变化的特点，以期为槟榔黄化病的综合防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 采样时间和地点

2个采样地点分别位于海南省琼海市嘉积镇（110.40°E，19.20°N）和 万 宁 市 龙 滚 镇（110.50°E，19.05°N），采样时间为2019年2月至2020年1月每月的中下旬，树龄均为10年。

1.1.2 试验材料

每个槟榔园选取10株感病植株，采集植株下部倒数第2张羽状复叶上的小叶。琼海市和万宁市采样点植株样品编号分别为QH1～10和WN1～10。健康槟榔叶片采自海南省儋州市宝岛新村。

1.2 方法

1.2.1 槟榔叶片总DNA的提取

每片小叶上随机选取3个部位，混合磨样。采用QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit试剂盒提取槟榔叶片总DNA，提取方法详见试剂盒说明，提取的DNA于-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 槟榔黄化植原体的检测

槟榔黄化植原体检测参考车海彦等［11］的方法。以本实验室保存的含有槟榔黄化植原体的DNA样品为阳性对照，提取的健康槟榔叶片总DNA为阴性对照，无菌双蒸水为空白对照。以R16mF2/R16mR1［12］作为第一引物对，R16F2n/R16R2［13］作为第二引物对，进行巢式PCR（nested–PCR）检测，引物序列见表1。引物合成委托北京六合华大基因科技有限公司。直接PCR以1.2.1中提取的总DNA为模板，将直接PCR产物稀释50倍后作为巢式PCR的模板。

两次PCR反应体系均为25μL，含2×TaqPCR Mastermix 12.5μL、10 μmol/L的上游引物和下游引物各1μL，DNA模板1μL和灭菌ddH2O 9.5μL。PCR反应条件为：95℃预变性3 min；95℃变性45 s，50/52℃退火45 s（退火温度见表1），72℃延伸45 s，循环30次；72℃延伸10 min。

表1 引物序列

巢式PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，用Fusion FX7 Spectra多功能成像系统观察电泳结果。特异性片断长度约为1 200 bp，若存在特异性片断，检测结果为阳性，否则为阴性。

1.2.3 温度数据收集

从全国历史天气网站（http：//www.tianq‐ihoubao.com/lishi/）中获取海南省琼海市和万宁市2019年2月至2020年1月的月平均温度数据。

2 结果与分析

2.1 槟榔黄化植原体的检测结果

槟榔黄化植原体定株检测结果（图1、表2、图2）显示，不同月份，植原体检出率不同。琼海采样点植原体周年检出率为0～100%，万宁为0～80%。温度较高的月份植原体检出率远高于温度较低的月份，如在月平均温度最低的12月份，20株槟榔叶片中植原体的检出率为0。同时也发现，有些样品检测结果存在不稳定性，如QH8样品，在4、5、7、10月份均检测到植原体，但6、8、9月份未检测到植原体。上述结果说明，植原体在槟榔叶片内的含量周年内发生消长，植原体在叶片内的含量变化与温度有一定的相关性，槟榔黄化植原体在叶片中可能存在着分布不均匀的现象。

图1 2019年10月份采集样品的槟榔黄化植原体检测结果电泳图

2.2 槟榔黄化病田间症状随季节变化情况

根据多年的观察发现，由植原体引起的黄化病在初期会有明显的发病中心，田间有黄化型（图3-A）和束顶型（图3-B）2种典型症状。黄化型病株在发病初期，槟榔树倒数第2～3片叶缘1/4处开始出现黄化，植株能开花但不能正常结果，黄化症状逐年加重，田间感病植株大多表现此症状；束顶型病株的顶部叶片明显缩小，节间缩短，田间少部分病株表现此症状。感染黄化病的槟榔树只开花不结果，或者开花后花穗枯萎不能结果，或者开花后结少量品质较差的果实。

植原体引起的黄化症状与气候因素关系密切，会随季节变化而发生改变。11月至次年4月为旱季，降雨量较少，由植原体引起的黄化症状加重，但此时易与由干旱等因素导致的黄化症状相混淆。每年5～10月是海南岛的雨季，由植原体引起的轻症黄化病株叶片可能会完全转绿，中重症病株叶片症状会有所缓解，但轻症病株叶片转绿进程会慢于由干旱引起的叶片黄化植株。每年6月份是最容易根据田间症状识别槟榔黄化病的月份；此外，田间症状识别还应结合室内病原物的分子检测进行综合判断。

表2 两个采样地槟榔黄化植原体周年定株检测结果

图2 槟榔黄化植原体检出率和月平均气温关系图

图3 槟榔黄化病田间症状

3 讨论

植原体在寄主体内含量和分布部位可随季节发生一定的变动［14］。前人对几种林木植原体的病害研究发现，植原体在冬季到来之前从地上部运转到根部越冬，次年春天又回到地上部进行繁殖和危害，叶片内植原体含量随气温升高明显增加［15-17］。本研究中，槟榔黄化植原体病原在叶片中的检出率总体随着温度升高而增加，随着温度的下降而减少，说明槟榔黄化植原体在病株叶片内含量周年内发生消长；在一定的温度范围内，叶片中植原体含量与温度成正相关。温度降低时可能不利于植原体在叶片内繁殖，或叶片中的植原体转移到植株的其它部位。今后需通过进一步的实验来明确槟榔黄化植原体随季节变化在植株体内的分布规律。

槟榔是典型的热带植物，在旱季（每年11月至次年4月）缺水时，槟榔树尤其是幼树的叶片会表现出明显的黄化现象，此症状初期与黄化病引起的叶片黄化极为相似。随着雨季（每年5～10月）来临，水分充足，槟榔叶片会完全恢复绿色。感染黄化病的槟榔树，在旱季叶片黄化症状会加重，雨季来临后，黄化症状会有所缓解，但不能像因干旱引起的黄化那样完全恢复正常，由此可见，槟榔叶片黄化程度与水分条件存在明显的相关性。若槟榔园内植株发生黄化现象，但又未发现明显的发病中心，一定要结合室内分子检测来判断黄化现象是否为由植原体引起的病理性黄化。