QuEChERS结合HPLC-MS/MS同时测定琯溪蜜柚中36种农药残留

胡彧娴

(漳州市农业检验监测中心，福建 漳州 363000)

琯溪蜜柚是我国名优柚类品种[1]，原产于福建省平和县，已有500多年栽培历史[2]，其酸甜可口，营养丰富，具鲜食和药用双重价值，深受人们的喜爱。琯溪蜜柚作为漳州的主要经济作物，有较高的经济效益，已成为果农增加收入的主要途径。近年来种植规模不断扩大，据报道[3]2018年全市蜜柚种植面积约105万667m2、产量超过150万t，果品不仅在全国各地销售，同时还出口欧盟等40多个国家或地区。

种植过程中为防治果树病虫害的发生，提高蜜柚的产量，农药的使用成为果园管理的重要手段，阿维菌素、螺螨酯、乙螨唑、嘧菌酯等都是在蜜柚果园中经常用到的农药。随着蜜柚种植面积迅速扩大、种植结构过于单一，增加了果园病虫害发生的概率，而农药使用量也随之不断增加。一些禁止在柑橘类水果上使用的农药如灭多威、克百威、氧乐果、杀扑磷等在农产品质量安全监测中也偶有检出。近年来，蜜柚中的农药残留问题成为蜜柚质量安全关注的焦点之一，影响到蜜柚产业的发展。

农药多残留的样品前处理方法主要有液液萃取法[4]、固相萃取法[5]、凝胶渗透色谱(GPC)法[6]和QuEChERS法[7-9]等。QuEChERS(quick，easy，cheap，effective，rugged and safe)法是由Anastassiades等[10]于2003年提出，该方法相较于其它方法，操作简单、快速、有机溶液用量少，已在世界很多国家和地区得到验证和推广。检测方法主要有气相色谱(GC)法[11-12]、高效液相色谱(HPLC)法[13]、气相色谱-质谱(GC-MS)法[14]、气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)法[6，15]及高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法[16-17]等。HPLC-MS/MS具有灵敏度高，定性准确等特点，已成为测定农产品中农药多残留的重要检测手段。

国家标准GB 23200系列农残检测标准的前处理绝大部分都采用复杂的固相萃取方法，费时费力，有机溶剂用量也较大；此外经常在蜜柚上使用的农药如烯肟菌胺、乙唑螨腈等目前还没有相应的检测标准。故寻求QuEChERS结合HPLC-MS/MS同时快速检测蜜柚中多种农残的方法将有很大优越性及前沿性，具有实用性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 供试材料：琯溪蜜柚。

供试试剂：阿维菌素、螺螨酯、乙螨唑、灭多威、噻嗪酮、多菌灵、异丙威、嘧霉胺、氧乐果、克百威、啶虫脒、莠灭净、吡虫啉、甲霜灵、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、联苯肼酯、杀扑磷、克螨特、丙环唑、甲基硫菌灵、哒螨灵、唑虫酰胺、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、苯醚甲环唑、乐果、三环唑、烯酰吗啉、马拉硫磷、戊唑醇、咪鲜胺、烯肟菌胺、唑螨酯、乙唑螨腈、虫酰肼、毒死蜱等36种农药标准品(100mg/L)；氯化钠和无水硫酸镁(分析纯)；分散净化剂N-丙基乙二胺(PSA)；乙腈、甲醇(色谱纯)；甲酸(色谱纯)；试验用水为超纯水。

标准溶液的配制：准确吸取0.5mL各农药标准品(100mg/L)于25mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，配制成各农药组分均为2mg/L的混合工作液，于4℃冰箱中避光保存。根据需要分别用乙腈和空白样品基质稀释工作液，制备标准工作曲线溶液。

1.2 仪器与设备 DIONEX Ultimate 3000-Thermo TSQ Quantum Ultra EMR高效液相色谱-串联质谱仪(配有ESI源)；QUINTIX612上皿式天平；3-18K高速离心机。

1.3 分析方法

1.3.1 样品提取与净化 参考蔡恩兴[18]的方法并适当改动，称取10g(精确至0.01g)蜜柚样品置于50mL离心管中，加入20mL乙腈，4g无水硫酸镁和1g氯化钠，剧烈振荡2min，于4 500r/min的离心机中离心5min。离心后取2mL上清液转移至装有0.1g PSA、0.3g无水硫酸镁的15mL离心管中，涡旋混匀1min，以4 500r/min的离心机中离心5min，上清液过0.22μm有机滤膜，待高效液相色谱-串联质谱仪分析测定。

1.3.2 仪器工作条件

1.3.2.1 液相色谱条件 色谱柱：Atlantis T3 (100mm×2.1mm，3μm)；柱温：35℃；流动相A为甲醇，流动相B为0.1%甲酸水溶液；进样量：2.0μL；流速：0.25mL/min；梯度洗脱条件(表1)。

表1 梯度洗脱条件

1.3.2.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子源(ESI)；扫描方式为正离子扫描；检测方式为多反应监测(SRM)；喷雾温度为270℃；电喷雾电压为4 000V；离子传输管温度为300℃；鞘气(N2)流量为3.62L/min；辅助气(N2) 流量为5.38L/min；36种农药保留时间和质谱检测参数(表2)。

表2 质谱检测参数

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2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化 分别将1mg/L的36种农药标准溶液经注射泵注入ESI离子源中，选择正离子扫描模式，调节合适的注射泵流速及离子源气流、电压、温度使得待测物信号>106，且响应达到稳定状态。先通过母离子扫描确定每个化合物的母离子，再进行去簇电压(DP)的优化，然后对母离子进行子离子的扫描，并优化碰撞能量，选择丰度较高的2个特征碎片离子用于定性和定量，最终确定36种农药的质谱检测参数。

2.2 提取溶剂的选择 农药残留检测前处理常用到的提取溶剂较多，本试验考察了丙酮、甲醇、乙腈这3种溶剂提取效果。丙酮作为提取剂时提取液的颜色较深，较易提取出蜜柚样品中的杂质，且克百威、吡虫啉的回收率<60%；甲醇提取液的颜色虽然较丙酮浅，但回收率相对较差，多数目标物的回收率<60%，这可能与其较难与水层分离有关[15]。乙腈作为一种通用溶剂，其极性较强对大多数农药都能有效提取，且不易提出其他杂质和色素[19]，提取液颜色极浅，回收率能满足农药残留检测的要求，因此本试验选择乙腈作为提取剂。同时，试验对比发现，样品量和提取剂的比例为1：2时保证了较好的回收率，而样品量和提取剂的比例采用1：1时，回收率较差，这与孔志强等[20]的试验结果类似。

2.3 基质效应 在高效液相色谱-串联质谱分析中，基质效应(ME)的存在不可避免，可能对目标化合物的质谱信号产生抑制或增强效应。基质效应计算公式[21]如下：

其中Sm代表基质匹配标准曲线的斜率，Ss代表溶剂标准曲线的斜率。

当ME为-20%～20%时表示弱基质效应；当-50%～-20%或20%～50%时表示中等基质效应；当<-50%或>50%时表示强基质效应[22]。

不同农药在高效液相色谱-串联质谱测定中表现出来的基质效应(图1)，在蜜柚基质中各有50%的农药表现出基质抑制效应和增强效应。基质效应大部分表现为弱基质效应，占比61.1%，其中27.8%为弱抑制效应，33.3%为弱增强效应；36.1%的农药表现为中等基质效应，只有2.8%的农药(甲基硫菌灵)表现为强抑制效应，没有农药表现为强增强效应。由此可见，蜜柚基质的干扰较大，不同的农药表现出来的基质效应有所不同，因此试验中有必要采用基质匹配标准曲线进行定量分析，以降低基质效应对检测结果的影响。

图1 36种农药在蜜柚中的基质效应

2.4 添加回收试验 在蜜柚空白样品中分别加入3个不同水平的标准工作溶液进行添加回收试验，每个水平重复6次。按1.3.1和1.3.2方法进行前处理和上机测定，采用基质匹配标准溶液-外标法定量，计算平均回收率和相对标准偏差(RSD)，结果(表3)，36种农药在蜜柚中的平均回收率为73.3%～108.8%，相对标准偏差为1.4%～10.8%。

表3 36种农药在蜜柚中的添加回收率和相对标准偏差

续表

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2.5 线性范围和灵敏度 通过向蜜柚空白基质添加不同浓度的混合标准工作溶液，配制基质匹配系列标准溶液并进样分析，以基质匹配标准工作溶液的质量浓度为横坐标、对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线并对两者的相关性进行回归分析。结果(表4)显示，36种农药在0.5～200μg/L范围内线性关系良好，相关系数(r2)除灭多威为0.997 8外，其他35种农药均>0.999。以信噪比(S/N)的3倍和10倍作为仪器的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，该仪器检出限为0.01～0.25μg/kg、定量限为0.03～0.80μg/kg；以添加回收试验中最低浓度水平作为方法的定量限，其方法定量限除螺螨酯、灭多威、吡虫啉、苯醚甲环唑为5μg/kg，其余均为2μg/kg。

表4 36种农药在蜜柚中的回归方程、相关系数、检出限和定量限

3 结论

本试验建立了QuEChERS结合高效液相色谱-串联质谱检测方法，采用基质匹配标准溶液-外标法定量，在较短时间内同时完成对蜜柚中36种农药残留进行定性定量检测。36种农药在蜜柚中的平均回收率为73.3%～108.8%，相对标准偏差为1.4%～10.8%，方法定量限除螺螨酯、灭多威、吡虫啉、苯醚甲环唑为5μg/kg，其余均为2μg/kg。该分析方法操作简单，操作过程耗时较短，有机溶液用量少，回收率和精密度均较高，符合农药残留分析的要求[23]，具有较强的实际应用价值。