基于金纳米颗粒修饰石墨烯纸电极用于大肠杆菌O157︰H7的免疫阻抗分析

樊凯 陈移平 陈晶晶 王剑平 王维琴

最近几年中，食源性致病菌的爆发已经成为了公众普遍关注的重要公共安全问题。在众多的食源性致病菌中，大肠杆菌O157：H7尤为引起注意，主要是它能引起威胁生命的并发症，如出血性结肠炎等。因此，开发相应的可有效检测大肠杆菌O157：H7的方法显得尤为重要。

目前被用于检测大肠杆菌O157：H7的检测方法主要有细菌分离培养法、酶联免疫吸附法（ELISA）以及逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法等。这些方法各有各的不足，有的方法耗时长、灵敏度低、成本高，需要实验室环境以及专业操作人员。最近，免疫传感器（基于抗原抗体结合）在检测大肠杆菌O157：H7中的作用显得越来越重要。在众多免疫传感器中，阻抗免疫传感器由于其免标记、快速以及可便携化的优势，在检测大肠杆菌O157：H7中的优势也非常明显。而在免疫传感器方面，依然需要新的电极材料来构建高灵敏度、低成本以及小型化的阻抗免疫传感器。

石墨烯是一种单层碳原子的蜂窝状二维纳米结构，被认为是一种新型以及有效的电极材料。石墨烯材料的主要特性是有大的比表面积、优异的生物相容性，最为重要的是它可以加速电解质物质和电极之间的电子传递。另外，金纳米颗粒的独特特性能够为生物分子的固定提供合适的微环境，并加速生物分子与电极之间的电子传递。

在本研究中，我们开发了一种新型的阻抗生物传感器用于大肠杆菌O157：H7的检测，主要基于纳米金修饰的石墨烯纸电极。通过抗体的固定，新型的阻抗生物传感器对于大肠杆菌O157：H7的检测表现出了良好的分析特性。

一、试验部分

1.试剂及仪器。氧化石墨烯溶液（2mg/mL），购买自先锋纳米（南京）；抗壞血酸、氢碘酸，购买自阿拉丁试剂（上海）；大肠杆菌O157：H7、兔抗-大肠杆菌O157：H7、LB培养基、牛血清白蛋白，均购买自生工生物（上海）。EDC、NHS，购买自Sigma-Aldrich（美国）；电化学工作站，购买自辰华仪器（上海）。

2.纳米金/石墨烯纸复合电极的制备。使用抗坏血酸（2mg/mL）初步还原氧化石墨烯溶液，使用50mm直径和0.22μm孔径的滤纸进行真空抽滤，加入氢碘酸进行二次还原，并氮气吹干获得还原的石墨烯纸电极，最终在电化学沉积下实现纳米金的修饰。

3.免疫传感器的制备。抗体的固定主要使用EDC/NHS体系来进行修饰，然后把一系列的细菌溶液（9.2×10²-9.2×10⁷cfu mL-1）加入到溶液中，进行检测。

二、结果与讨论

1.免疫传感器的分析性能。为了定量评估免疫传感器的性能，主要是动态检测范围以及检测限，主要记录了9.2×10²-9.2×10⁷cfu mL-1细菌溶液的奈奎斯特图。如图1所示，阻抗谱的半圆直径随着大肠杆菌O157：H7浓度的增加而变大。并且，电子转移阻抗（Ret）在9.2×10²-9.2×10⁷cfu mL-1的范围内表现出了良好的线性范围。如图1所示，将大肠杆菌O157：H7浓度的对数与传感器阻抗拟合后的线性回归方程为：Y（Ω）=355.24+106.43X（log cfu mL-1）（R2=0.995）。阻抗免疫传感器的检测限为4.6×10²cfu mL-1。

我们还对阻抗免疫传感器针对大肠杆菌O157：H7的特异性进行评价。主要测试了其他类型的细菌，如大肠杆菌DH5α、金黄色葡萄球菌以及单核李斯特菌等。当浓度均为10⁷cfu mL-1时，其他细菌没有对传感器造成相应的干扰，表明了该传感器对于大肠杆菌O157：H7的特异性。此外，该免疫传感器的主要性能依赖于捕捉抗体的活性。将免疫传感器放置在4℃的冰箱中，每天检测免疫传感器的性能，结果发现，免疫传感器在一个月之后依然保持93.1%的性能。该免疫传感器良好的特异性以及稳定性很好地说明了还原石墨烯纸以及金纳米颗粒良好的生物相容性，从而能够很好地保持抗体及其他生物分子的生物活性。

2.实际样本检测。我们同样研究了基于还原石墨烯纸阻抗免疫传感器用于实际食品样品中的大肠杆菌O157：H7检测的可行性。我们选取两种食物样本，包括牛肉和黄瓜。我们同样绘制了在牛肉和黄瓜中检测大肠杆菌的浓度曲线，得到了在黄瓜和牛肉中，传感器的检测限分别为4.6×10³cfu mL-1和4.6×10⁴cfu mL-1。结果表明，该传感器可以用于复杂食品样本中的大肠杆菌O157：H7的检测。

在本研究中，我们开发了一种简单灵敏的阻抗免疫传感器用于大肠杆菌O157：H7检测。该纸免疫传感器的优势在于灵敏度高、选择性好，以及良好的重复性和稳定性等，可用于大肠杆菌O157：H7的检测中，值得大力推广。