基于组方药味古今炮制工艺的经典名方桃红四物汤质量差异性研究

王升菊 ，郑 雨，段 赟，江华娟 ，王 琳，李固良，何 瑶，章津铭*，裴 瑾 *

1.西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137

2.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137

桃红四物汤（Taohong Siwu Decoction，TSD）出自清代柴得华所著《妇科冰鉴》[1]，是国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录（第一批）》[2]的经典名方品种之一（编号97）。古籍记载处方用量及制法为：“生地三钱（酒洗），当归四钱（酒洗），白芍钱五分（酒炒），川芎一钱，桃仁十四粒（去皮尖研泥），红花一钱（酒洗）。水煎温服。”TSD具有养血、活血、逐瘀的功效，主治血虚血瘀证，症见妇女月经不调、血多有块、色紫质黏、腹痛腹胀等。被历代医家推崇为治疗妇科疾病的首选良方。临床多用于治疗痛经、月经不调、乳腺癌等诸多瘀血类妇科疾病[3-4]。

地黄以酒为辅料进行炮制首见于梁代《本草经集注》[5]：“地黄…得清酒良”。宋代《洪氏急验方》[6]始载生地黄“酒洗”。金元时期《世医得救方》[7]记载地黄“酒炒”；此外还沿用了“酒蒸”“酒煮”“酒浸”等。考证发现地黄酒洗本意为用酒将药材润，润透后进行干燥的方法；《雷公炮炙论》[8]首载当归以酒为辅料炮制当归，原文记载“凡使（当归）…酒浸一宿”，所用辅料为酒，与现代使用辅料一致。唐宋时期除沿用酒浸及炒法外，还新增酒洗。明代《药性会元》[9]详细记载当归酒洗之法：“夏酒洗，切，焙干用”，方法与今酒炙法类似。元代《汤液本草》[10]记载当归“微炒黄”，其炒制程度与现代一致，并首次提到酒炙法理论。说明酒炒和酒洗是历代当归主流的炮制方法；红花以酒为辅料的炮制方法始见于宋《开宝本草》[11]，原文记载“并酒煮服”。明代也有“红花酒洗”的记载，另有“慢火微炒”“酒炒”，即现代“酒炙”法。可见历代红花以酒处理后进行干燥为主流；综上，地黄、当归、红花的“酒洗”之意即为用酒将药材润透后烘干；“酒炙”之意即为用酒将药材润透后炒干。

“酒洗”一词始见于汉代张仲景《伤寒论》[12]中，原文记载大黄“去皮，清酒洗”，并用于调味承气汤中。《古代经典名方目录（第一批）》目录中有7首方剂与“酒洗”相关，涉及的药材有大黄（汉）、当归（金、明、清）、肉苁蓉（明）、生地黄（清）、红花（清），而古籍中并未明确“酒洗”的具体操作。TSD复方中生地、当归、红花均为“酒洗”，因此可作为代表方进行酒洗研究。

课题组前期通过参考《上海市炮制规范》2018年版[13]中当归、大黄“酒洗”标准，研究确定了3个药味的最佳“酒洗”工艺。2020年11月国家中医药管理局公布的《古代经典名方关键信息表（7首方剂）》[14]中公布了TSD中6味药的炮制规格为酒地黄，酒当归，酒白芍，生品川芎，燀桃仁（研泥），酒红花。不再强调酒洗，但并未明确如何酒制。其中还提到TSD“鉴于古代酒洗炮制方法演变到现代，与酒炙法内涵基本一致，且有国家标准，建议采用酒炙法”[14]。但组方药物尊古“酒洗”与现代“酒炙”对经典名方制剂质量是否存在差异，仍不清楚。因此，本研究按照TSD制备方法制备了生品煎液、药典“酒炙”煎液以及尊古“酒洗”煎液。借助超高效液相色谱系统（UPLC）建立了TSD指纹图谱，并通过多元统计分析和化学成分分析，评价组方药物生品、药典“酒炙”、尊古“酒洗”的TSD之间的质量差异，筛选出对煎液整体质量贡献较大的成分，并检测其含量。为TSD的质量属性控制以及经典名方复方制剂炮制研究提供参考。

1 仪器与试药

UltiMate3000超高效液相色谱仪，美国Thermo Fisher公司；色谱柱Eclipse Plus C18（150 mm×3.0 mm，1.8 μm），美国Agilent公司；XP26型百万分之一电子天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司；KQ-600DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；FTS-10A全自动煎药壶，潮州市一壶百饮电器实业有限公司。DGH-9000电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。对照品羟基红花黄色素A（批号wkq18010407）、5-羟甲基糠醛（批号wkq19010805）、苦杏仁苷（批号wkq19012401）、芍药苷（批号wkq20041008）、苯甲酸（批号wkq18031305）、阿魏酸（批号wkq20010902）、绿原酸（批号wkq20010902）、芍药内酯苷（批号wkq18052205）、没食子酸（批号wkq20010902），质量分数均大于99.0%，均购自四川省维克奇生物科技有限公司。炮制用黄酒，产品标准号：GB/T13662，浙江塔牌绍兴酒有限公司；甲醇、乙腈为色谱醇，赛默飞世尔科技有限公司；磷酸为色谱级，成都市科隆化学品有限公司；水为超纯水。

TSD组方药味地黄、当归、白芍、川芎、桃仁、红花原药材产地信息见表1，6味药均收集5个批次，于2020年7月课题组统一购进。经成都中医药大学药学院裴瑾教授鉴定品种，鉴定结果依次为红花为菊科红花属植物红花Carthamus tinctoriusL.的干燥花，桃仁为蔷薇科樱桃属植物桃Prunus persica(L.) Batsch的干燥成熟种子，川芎为伞形科藁本属植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根茎，当归为伞形科当归属植物当归Angelica sinensis(Oliv.) Diels的干燥根，白芍为毛茛科芍药属植物芍药Paeonia lactifloraPall.的干燥根，地黄为玄参科地黄属植物地黄Rehmannia glutinosaLibosch.的干燥块根。且课题组按照《中国药典》2020年版一部项下规定的质量检查方法，对6个药味进行显微鉴别、薄层色谱鉴别和指标性成分含量测定，均符合《中国药典》2020年版一部各药材项下规定。

表1 TSD中各药味产地信息Table 1 Origin information of decoction pieces in TSD

2 方法与结果

2.1 饮片炮制

2.1.1 生品炮制方法 参照《中国药典》2020年版第四部[7]“炮制通则”“净制”项下规定，制定地黄、当归、白芍、川芎的切制方法。

2.1.2 药典“酒炙”法 参照《中国药典》2020年版四部“炮制通则”项下“酒炙”法的规定，制定酒炙地黄、酒炙当归、酒炙白芍、酒炙红花的炮制方法。

2.1.3 尊古“酒洗”法 参照《上海市中药饮片炮制规范》2018年版[13]当归项下“酒洗”法的规定，制定酒洗地黄、酒洗当归、酒洗红花的炮制方法。

每个药味的具体炮制方法见表2。

表2 各味药材炮制方法Table 2 Processing method of medicinal materials

2.2 TSD供试样品的制备

《妇科冰鉴》[1]中记载TSD的用法和用量为“生地三钱（酒洗），当归四钱（酒洗），白芍一钱五分（酒炒），川芎一钱，桃仁十四粒（去皮尖研泥），红花一钱（酒洗）”。《古代经典名方关键信息表（7首方剂）》[14]公布其折合现代剂量为生地黄11.19 g，当归14.92 g，白芍5.60 g，川芎3.73 g，桃仁3.78 g，红花3.73 g。取处方的3倍剂量，共128.85 g，第1次加10倍量水，浸泡30 min，煎煮1 h，纱布滤过，第2次加8倍量水，煎煮30 min，合并2次煎液，定容至约2 L，静置，取上清液，0.22 μm微孔滤膜滤过，制得TSD煎液。不同批次的组方按照对应的方法组合为复方（如S1样品：DHYC-1、DGYC-1、BSYC-1、CXYC-1、TRYC-1、HHYC-1，S2～S5以此类推），3种炮制方法按照5个批次各制备5份煎液，共得15批TSD样品，生品组5份煎液按批次依次编号S1～S5，药典“酒炙”组5份煎液按批次依次编号S6～S10，尊古“酒洗”组5份煎液按批次依次编号S11～S15，用于后续实验。

2.3 TSD阴性样品的制备

按3倍处方量分别称取缺地黄、当归、川芎、白芍、桃仁、红花其他5味药，缺当归川芎其它4味药的饮片，按“2.2”项下制备方法制得缺地黄、缺当归、缺川芎、缺当归川芎、缺白芍、缺桃仁、缺红花7个阴性煎液。

2.4 TSD煎液特征图谱研究

2.4.1 对照品溶液的制备 取羟基红花黄色素A、芍药内酯苷、没食子酸、5-羟甲基糠醛、芍药苷、苯甲酸、阿魏酸、绿原酸对照品，精密称定，加50%甲醇制成分别含羟基红花黄素色A 504 μg/mL、芍药内酯苷436 μg/mL、没食子酸406 μg/mL、5-羟甲基糠醛444 μg/mL、芍药苷216 μg/mL、苯甲酸160 μg/mL、阿魏酸265 μg/mL、绿原酸233 μg/mL的对照品溶液，分别吸取1 mL上述对照品溶液，制得混合对照品溶液。

2.4.2 色谱条件 色谱仪为UltiMate3000超高效液相色谱仪；色谱柱为SunFireC18柱（150 mm×3.0 mm，3.5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～3 min，5%乙腈；3～10 min，5%～15%乙腈；10～25 min，15%～25%乙腈；25～35 min，25%～85%乙腈；35～37 min，85%乙腈；37～40 min，85%～5%乙腈；40～45 min，5%乙腈；检测波长为230 nm；柱温30 ℃；体积流量0.3 mL/min；进样体积10 μL。

2.4.3 精密度试验 取同一供试品溶液（S1），按“2.4.2”项下色谱条件测定，连续进样6次，计算5-羟甲基糠醛、没食子酸、绿原酸、羟基红花黄色素A、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸峰面积的RSD分别为3.17%、8.09%、2.74%、4.2%、3.26%、1.74%、1.7%、0.92%；以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》（2012.130723版）评价，6次进样相似度为1，表明该仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验 取同一批次样品（S1），按照“2.2”项下样品制备方法平行制备6份，按照“2.4.2”项下色谱条件测定，计算5-羟甲基糠醛、没食子酸、绿原酸、羟基红花黄色素A、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸质量分数的RSD依次为0.76%、4.59%、0.94%、0.75%、3.42%、3.83%、4.28%、1.34%；以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》（2012.130723版）评价，6次进样相似度为1，表明该方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验 取同一供试品溶液（S6），分别于制备后0、2、4、8、12、24 h按照“2.4.2”项下色谱条件进样测定，结果5-羟甲基糠醛、没食子酸、绿原酸、羟基红花黄色素A、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸峰面积的RSD分别为1.26%、1.59%、0.77%、0.85%、4.33%、4.13%、3.15%、4.84%；以《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》（2012.130723版）评价，6次进样相似度为1，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.6 特征图谱相似度评价 将生品、药典“酒炙”和尊古“酒洗”煎液特征图谱的cdf格式导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》（2012.130723版）进行分析。以S1号样品的UPLC特征图谱作为参照图谱进行指纹匹配，利用平均数法，设置时间窗口为0.1 min，共确定了20个共有峰、15批TSD的特征图谱叠加图（图1），并进行相似度计算（表1），结果发现S1～S5、S6～S10、S11～S15组内的相似度均≥0.996，说明同一炮制方法制备样品差异较小。但3个炮制组间的相似度均≤0.980，表明生品、药典“酒炙”和尊古“酒洗”煎液间存在差异。

图1 15批TSD的UPLC特征图谱与对照特征图谱 (R)Fig.1 UPLC characteristic map and control characteristic map (R) of 15 batches of TSD

表3 15批TSD的相似度结果Table 3 Similarity results of 15 batches of TSD

2.4.7 色谱峰化学成分指认及归属 通过与对照品比对（图2），共指认了8个色谱峰，色谱峰依次为5-羟甲基糠醛（3号峰）、没食子酸（4号峰）、绿原酸（7号峰）、羟基红花黄色素A（8号峰）、芍药内酯苷（9号峰）、芍药苷（10号峰）、阿魏酸（14号峰）、苯甲酸（17号峰）；根据阴性物质基准色谱图（图3），确定羟基红花黄色素A为红花的专属性成分；5-羟甲基糠醛归属于地黄；芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸为白芍的专属性成分；阿魏酸归属于当归和川芎。

图2 TSD中各单味药主要成分指认Fig.2 Identification of characteristic components of each single medicine in TSD

图3 TSD中各成分归属Fig.3 Attribution of components in TSD

2.4.8 层次聚类分析（hierarchical clustering analysis，HCA） 运用SPSS 21软件对S1～S15批次样品进行HCA，以20个共有峰作为分类依据，选择系统聚类分析，采用组间连接法，欧式距离为度量标准，聚类结果如图4所示，生品聚为一类，药典“酒炙”聚为一类，尊古“酒洗”聚为一类，且药典“酒炙”和尊古“酒洗”聚为一个大类。

图4 生品 (S1～S5)、药典“酒炙”法 (S6～S10)、尊古“酒洗”法 (S11～S15) 样品的HCAFig.4 HCA result of original medicinal materials (S1—S5),Pharmacopoeia “stir-fried wine” (S6—S10), and ancient“wine washing” (S11—S15)

2.4.9 主成分分析（principal component analysis，PCA） 以15批次生品煎液、药典“酒炙”和尊古“酒洗”为研究对象，将20个共有峰的数据导入SPSS 21统计软件进行无监督的PCA，通过降维处理后提取主成分特征值、累积贡献率和主成分因子载荷值。前4个主成分的累积方差贡献率值为92.898%，说明该模型预测能力较好，其中PC1方差贡献率为55.264%，说明成分1所含信息量较大。主成分因子的特征值和方差贡献率见表4。主成分载荷值可代表各色谱峰对主成分的贡献率，载荷的绝对值越大，对主成分的贡献越大，从表5可知，第1主成分的信息主要来自于色谱峰20、8（羟基红黄色素A）、14（阿魏酸）、2、3（5-羟甲基糠醛）、18。第2主成分的信息主要来自于色谱峰16、12、10、9（绿原酸）、5。第3主成分信息主要来自于色谱峰6。第4主成分的信息主要来自于色谱峰1。主成分3D图见图5。

图5 主成分3D图Fig.5 3D diagram of principal components

表4 主成分因子的特征值和方差贡献率Table 4 Eigenvalue and variance contribution rate of principal component factor

表5 主成分载荷Table 5 Principal component load

2.4.10 偏最小二乘-判别分析（partial least square-discriminant analysis，PLS-DA） 本研究进一步采用有监督的PLS-DA对15批次样品进行分析，通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件得到15×20阶矩阵，将数据导入SIMCA 14.1软件，选取20个色谱峰的相对峰面积值作为变量，PLS-DA结果见图6。结果显示，在置信区间（95%）内，生品汤剂、现代汤剂和尊古汤剂能明显分开，根据分布将S1～S5分为一类，S6～S10分为一类，S11～S15分为一类，即同种炮制方法所得煎液样品差异较小，不同炮制方法所得煎液样品差异较大。

图6 生品 (S1～S5)、药典“酒炙”(S6～S10)、尊古“酒洗”(S11～S15) 的PLS-DA得分图Fig.6 PLS-DA score plot of original medicinal materials(S1—S5), Pharmacopoeia “stir-fried wine” (S6—S10) and ancient “wine washing” (S11—S15)

为进一步搜寻出对上述样品分类贡献值较大的成分，采用变量重要性投影（variable importance in project，VIP）进行分析（VIP值越大，表明对样品分类贡献越大），其中有10个成分VIP值＞1，按照VIP值由大到小分别对应峰号为12、5、16、9（绿原酸）、13、3（5-羟甲基糠醛）、7、14（阿魏酸）、4、8（羟基红黄色素A），以上10个成分可能是不同炮制方法的重要差异性成分，也是酒炙与酒洗的差异质量标志性成分。见图7。

图7 TSD煎液中20个共有成分的VIP值Fig.7 VIP values of 20 common components in material reference of TSD

2.5 羟基红花黄色素A、阿魏酸、5-羟甲基糠醛的含量测定

2.5.1 线性关系考察 精密称取羟基红花黄色素A 4.35 mg、阿魏酸4.36 mg、5-羟甲基糠醛8.08 mg，加50%甲醇稀释通过二倍稀释法制得6个不同质量浓度的对照品溶液，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），进行线性回归，得到回归方程分别为羟基红花黄色素AY＝0.102X＋3.021 7，r＝0.999 1，线性范围13.594～435 μg/mL；阿魏酸Y＝0.270 8X＋2.667 3，r＝0.999 3，线性范围13.593 8～436 μg/mL；5-羟甲基糠醛Y＝0.234 6X＋1.778 2，r＝0.999 2，线性范围12.625～404 μg/mL；结果表明，各个对照品的线性关系良好，r均大于0.999。

2.5.2 加样回收率考察 取S1批次样品约0.2 g，分别精密添加已知各成分质量浓度的对照品溶液适量，按照“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照按照“2.4.2”项色谱条件进样，测定峰面积，计算羟基红花黄色素A、阿魏酸、5-羟甲基糠醛的加样回收率。结果显示，3个成分的平均加样回收率依次为99.62%、100.46%、99.47%，RSD分别为1.26%、1.66%、0.89%。结果表明含量测定方法准确可靠。

2.5.3 含量测定结果 取S1～S5生品、S6～S10药典“酒炙”和S11～S15尊古“酒洗”供试品，按照“2.4.2”色谱条件检测，含量测定结果见表7，结果显示羟基红花黄色素A和阿魏酸在炮制后含量下降，而5-羟甲基糠醛在炮制后升高。相对于药典“酒炙”，尊古“酒洗”中羟基红花黄色素A含量增加3.84%；阿魏酸含量增加2.47%，而5-羟甲基糠醛含量降低9.07%。

表7 羟基红花黄色素A、阿魏酸、5-羟甲基糠醛含量测定结果Table 7 Determination of hydroxysafflor yellow A, ferulic acid and 5-hydroxymethylfurfural

3 讨论

本实验在流动相洗脱系统考察时，对比了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.5%磷酸水溶液等不同体积分数、不同洗脱梯度，结果发现，乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相梯度洗脱时，峰形较佳，各峰分离度较好。实验采用UPLC-DAD法对供试品进行全波长扫描，分析3D图谱，发现230 nm波长下出峰较多，基线平稳且各色谱峰响应值较高。实验还比较了25、30、35 ℃下色谱峰的分离效果，结果显示以30 ℃分离效果最佳。最终确定色谱条件以乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相，体积流量为0.3 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。

《古代经典名方关键信息考证原则》[15]指出“信息考证在尊古的基础上充分考虑当前临床和生产实际，传承不泥古，用历史和发展的角度去认识经典名方中药物炮制等关键共性问题”。本次研究对生品煎液、药典“酒炙”、尊古“酒洗”进行了相似度评价、聚类分析、PLS-DA分析以及PCA，结果发现，3种汤剂批次内相似度大于0.996，说明物质基准制备的均一性与稳定性。而组间相似度均小于0.980，且多元统计分析结果显示，3个组能有效聚为3类，说明炮制组间存在差异。对20个共有峰进行主成分分析，前4个主成分的累积方差贡献率值为92.898%。其中第1主成分载荷值较大的成分有羟基红黄色素A、阿魏酸、5-羟甲基糠醛等已被识别的化合物。第2主成分载荷值较大的有被指认的绿原酸等。采用PLS-DA分析对分类贡献值较大的成分，发现已被指认的绿原酸、5-羟甲基糠醛、阿魏酸、羟基红黄色素A等成分的VIP值大于1，2种统计分析方法结论趋于一致，其统计结果说明以上4种成分可能是影响不同炮制组别质量的标志性差异物质。本次研究对质量标志性物质羟基红花黄色素A、阿魏酸、5-羟甲基糠醛进行含量测定。羟基红花黄色素A属于查耳酮类化合物，是《中国药典》2020年版规定的红花指标性成分，也是红花发挥活血化瘀药效的主要成分[16]。研究表明[17-18]，羟基红花黄色素A是热不稳定性成分，遇热易分解。结果显示红花酒制后煎液中羟基红花黄色素A含量降低，且酒炙后下降更为明显，说明酒洗低温干燥更利于红花的质量。阿魏酸来源于于当归，具有抗炎活性[19]。研究表明[20]，阿魏酸会随着温度的升高，含量降低。5-羟甲基糠醛归属于地黄，有研究认为，5-羟甲基糠醛受高温和加热影响，在高温条件下，药材中的葡萄糖、果糖等单糖化合物发生美拉德反应，脱水生成5-羟甲基糠醛[21]。所以地黄“酒炙”后5-羟甲基糠醛含量会明显升高。绿原酸因专属性不强，所以剔除。综上，提示羟基红黄色素A、阿魏酸、5-羟甲基糠醛化合物可作为质量标志性差异物质对TSD进行质量控制。

本次研究综合评价了TSD组方药味生品煎液，“酒炙”煎液以及“酒洗”煎液间的质量差异。结果显示相对于生品，药典“酒炙”与尊古“酒洗”2种不同炮制工艺均导致TSD样品质量的差异，且“酒炙”和“酒洗”炮制品二者间也存在质量差异。因此现代“酒炙”与尊古“酒洗”之间的差异性值得深入探讨，后续课题组将综合药效学研究综合评价炮制工艺的合理性。本次研究结果为TSD的质量属性控制提供基础，以及为经典名方复方制剂炮制研究提供实验依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突