基于UHPLC-Q-Exactive质谱法分析桔红素在大鼠体内的代谢过程

马贝贝，娄天宇，梁耀月，王婷婷，李瑞吉，刘金辉，王晨晓，于尚玥，郭玉东，王 晶*，王志斌

1.北京中医药大学中药学院，北京 102488

2.北京市药品检验所，北京 102200

3.同仁堂科技发展股份有限公司，北京 100071

桔红素（tangeretin），又被称为橘红素、蜜桔素、桔皮素或5,6,7,8,4′-五甲氧基黄酮，作为一种天然的多甲氧基黄酮类化合物（polymethoxylated flavones，PMFs），主要存在于芸香科植物酸橙Citrus aurantiumLinn.和川橘C.nobilisLour.的果皮以及柑橘C.reticulataBlanco.的叶和茎中[1-3]。近年来国内外研究表明，桔红素具有较强的药理活性，如可减轻脂多糖诱导的急性肺损伤、抑制氧化应激和炎症、保护人脑微血管内皮细胞以及抑制链脲佐菌素诱导的细胞凋亡等[4-7]。此外，桔红素还可抗肿瘤、抗癫痫以及阻断病毒融合、治疗拉沙病毒引起的病毒性出血热，被广泛应用于食品保健和医学研究[8-10]。然而有关桔红素的体内代谢研究却鲜有报道，急需一种快速有效的分析方法详细阐明桔红素的代谢产物和代谢途径[11-12]。

超高效液相色谱-高分辨质谱技术（UHPLCHRMS）将色谱分离与质谱结构解析相结合，同时具备高选择性、高灵敏度及高精准度的独特优势，使迅速分离成分与结构信息获取一体化，从而频繁应用于药物成分检测和快速筛查[13-16]。四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪（Q-Exactive Orbitrap MS）将四极杆对母离子的高选择性与提供准确质量数的高分辨Orbitrap技术相统一，检出限度小，质量偏差范围窄，可显著消除样品基质的干扰，实现对复杂样品的定性和定量分析[17-20]。固相萃取法（solid-phase extraction，SPE）是21世纪以来蓬勃兴起的样品前处理技术，可使分离、纯化与浓缩同步完成，常被用于多甲氧基类黄酮等柑橘中的有效成分在动物体内的代谢研究[21-23]。

因此，本研究采用SPE法提取生物样品，纯化后通过UHPLC-Q-Exactive MS技术分析桔红素在大鼠体内的代谢产物，以期剖析其在动物体内的代谢过程。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Thermo Fisher Ultimate 3000超高效液相色谱仪和Q-Exactive质谱（美国Thermo Fisher公司），配有电喷雾离子源（ESI）；Xcalibur 2.1工作站；R200D分子天平（十万分之一，德国Sartorius公司）；Milli-Q Synthesis超纯水纯化系统（美国Millipore公司）；KQ-250DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；OASIS HLB C18固相萃取小柱（3 L/60 g，美国Waters公司）。

1.2 试剂

桔红素对照品（成都曼思特生物科技有限公司，质量分数＞98%，批号MUST-18012910）；乙腈和甲醇（质谱级，美国Thermo Fisher公司）；甲酸（色谱级，德国Merck公司）。

1.3 动物

SPF级SD大鼠（雄性，200～220 g），购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2016-0011。本研究由北京市药品检验所实验动物伦理委员会审查通过，实验动物使用许可证号SYXK（京）2015-0033。

2 方法

2.1 供试品溶液的配制

称取桔红素对照品480 mg，溶解于16 mL 0.5%的羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液中。

2.2 色谱条件

色谱柱为Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温25 ℃；流动相为0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0～1 min，5% B；1～3 min，5%～25% B；3～8 min，25%～60% B；8～15 min，60%～80% B；15～20 min，80%～100% B；20～24 min，100% B；24～25 min，100%～5% B；25～30 min，5% B；体积流量为0.30 mL/min；进样量为2 μL。

2.3 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正离子扫描模式，毛细管温度350 ℃，鞘气（sheath gas）体积流量275 kPa，辅助气（aux gas）体积流量138 kPa，喷雾电压（source voltage）4 kV。碰撞能量（collision energy）40 eV。检测方式为Full MS/dd-MS2，Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，质量扫描范围m/z100～1500。

2.4 动物实验

将16只SD大鼠随机分为空白组与给药组，实验前于SPF级动物房适应性饲养1周（室温22～26 ℃，湿度40%～70%，12 h昼夜更替），喂药前禁食12 h，全程不禁水。

给药组以300 mg/kg的剂量ig给予桔红素溶液，空白组则ig等量的0.5%的羧甲基纤维素钠。

2.5 生物样品采集

待空白组与给药组大鼠给药完成后，置于代谢笼中，分别于0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 h眼内眦取血约0.5 mL置于肝素钠抗凝EP管中，静置15 min，于4 ℃下3000 r/min离心15 min，合并上述5个时间点的上清液，将空白组与给药组血浆分装保存（-80 ℃）。分别收集其24 h内排出的尿液与粪便，尿液于4 ℃下3000 r/min离心15 min，收集上清液分装（-80 ℃）。粪便烘干后研磨粉碎，分别称取2组粪便粉末各0.5 g，溶解于70%的乙醇中，超声提取30 min，收集溶液层保存（-80 ℃）。

2.6 SPE处理生物样品

将固相萃取小柱用5 mL甲醇与5 mL去离子水活化平衡，分别取解冻后的生物样品（血浆、尿液与粪便）各1 mL加入柱中，依次用5 mL去离子水和3 mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，室温下用氮气吹干，得到的残渣用100 μL初始比例流动相（5%乙腈溶液）复溶，涡旋震荡3 min，13 000 r/min离心15 min（4 ℃），收集上清液进行UHPLC- HRMS分析。

3 结果

3.1 桔红素对照品的质谱裂解行为分析

在正离子扫描模式下，桔红素产生准分子离子峰m/z373.127 62，分子式为C20H21O7（误差为-1.50 ×10-6）。在其ESI-MS2质谱图中，检测到的主要二级碎片离子有m/z358 [M－CH3]+、m/z343 [M－2CH3]+、m/z312 [M－2CH3－OCH3]+、m/z327 [MCH3－OCH3]+、m/z297 [M－3CH3－OCH3]+以及m/z345 [M－CO]+。通过对比黄酮类化合物的质谱裂解规律[24-25]，本研究以连续丢失CH3与OCH3、中性丢失CO作为此类化合物的在ESI正离子模式下的特异性裂解规律，以为下一步的代谢产物结构筛选与鉴定提供依据。桔红素在正离子模式下的多级质谱图见图1，其详细裂解途径见图2。

图1 桔红素在正离子扫描模式下的多级质谱图Fig.1 Multi-level mass spectrum of tangeretin in positive ion scanning mode

图2 桔红素对照品在正离子模式下的裂解途径Figure 2 Cleavage pathway of tangeretin in positive ion mode

3.2 大鼠体内桔红素的代谢产物分析与鉴定

基于UHPLC-Q-Exactive高分辨质谱技术分析大鼠给药后的尿液、血浆与粪便，通过对比空白组与给药组的生物样品色谱图，结合桔红素对照品的质谱碎裂规律、二级质谱裂解碎片、保留时间、精确相对分子质量以及脂水分配系数（calculated logP，ClogP），最终鉴定出包括原型在内的28个代谢产物，其中尿液中有18个、血浆中有22个、粪便中有26个。鉴定结果见表1。空白组与给药组的血浆、尿液与粪便的总离子流图见图3。

图3 大鼠生物样品的总离子流图谱Fig.3 Total ion chromatograms of biological samples from rats

表1 大鼠尿液、血浆和粪便中的代谢产物Table 1 Summary of tangeretin metabolites in rat urine, plasma and feces

在正离子扫描模式下，代谢产物M0的色谱保留时间为9.71 min，精确相对分子质量为373.127 66，其质谱碎裂行为与桔红素对照品类似，结合文献报道[26-27]，可将其准确鉴定为桔红素。化合物M13、M19、M23以及M24在正离子模式下均产生m/z为359.112 48的准分子离子峰，较之桔红素少14（丢失了1分子CH2），由精确相对分子质量推测出它们的分子式都为C19H19O7，在ESI-MS2裂解过程中，它们都产生了m/z344（脱去1分子CH3）、m/z329（脱去2分子CH3）以及m/z311（脱去1分子H2O）的碎片离子，据此推断它们都是桔红素的去甲基化产物。根据反相色谱的洗脱行为，ClogP值越大的化合物越难被洗脱。因此代谢产物M13、M19、M23和M24分别为5,6,7,8-四甲氧基-4′-羟基黄酮（ClogP，1.80），5,6,7,4′-四甲氧基-8-羟基黄酮（ClogP，2.13），5,6,8,4′-四甲氧基-7-羟基黄酮或5,7,8,4′-四甲氧基-6-羟基黄酮（ClogP，2.23），6,7,8,4′-四甲氧基-5-羟基黄酮（ClogP，3.03）。

代谢产物M11、M18和M27均产生m/z375.107 43的准分子离子峰 [M＋H]+，推测分子式为C19H19O8，其相对分子质量比M13、M19、M23以及M24多16，推测为它们的羟基化产物。在它们的二级质谱图中都存在m/z345（丢失2分子CH3）、m/z327（失去1分子H2O）和m/z299（中性丢失1分子CO）等离子碎片，因此M11、M18和M27为桔红素发生去甲基化反应后的羟基化产物。

化合物M8在正离子模式下的准分子离子峰为m/z535.144 63，推测分子式为C25H27O13，其相对分子质量比M13多176，推测为M13、M19、M23以及M24的葡萄糖醛酸结合产物。在其ESI-MS2裂解过程中检测到m/z359（丢失1分子葡萄糖醛酸）以及m/z344、329、311等碎片离子，进一步证明其与M13的碎裂行为相似，因此可将M8鉴定为桔红素去甲基化和葡萄糖醛酸化复合反应产物。同理，M6的相对分子质量551.139 54比M11、M18及M27多176，二级质谱图中m/z375是由m/z551中性丢失1分子葡萄糖醛酸产生的，又根据m/z360、345、327等特征碎片将M6鉴定为桔红素去甲基化、羟基化和葡萄糖醛酸化复合反应产物。

代谢产物M16的准分子离子峰为m/z439.069 33[M＋H]+，推测分子式为C19H19O10S（误差为-1.47×10-6），比去甲基化桔红素的理论相对分子质量多80，推测为桔红素去甲基化和硫酸酯化反应产物。而之后连续丢失CH3以及中性丢失1分子水（分别产生m/z344, 329, 311）进一步证实了上述推断。与之相似，化合物M12（C19H19O11S）被鉴定为桔红素去甲基化、羟基化和硫酸酯化产物。

化合物M1、M3、M9、M15、M17和M25均产生准分子离子峰m/z345.096 98 [M＋H]+，推测其分子式为C18H17O7，分子质量比桔红素少28，推测为桔红素双去甲基化产物。在二级裂解过程中检测到m/z345、315、330等特征碎片，证明它们的裂解规律与桔红素类成分一致[28-29]，故将它们鉴定为桔红素双去甲基化反应产物（失去了2分子CH2）。而代谢物M5、M7及M22均产生m/z361.091 88的准分子离子峰，由Xcalibur推测分子式为C18H17O8，相对分子质量较M1多16，推测为M1类同分异构体的羟基化产物。在ESI-MS2质谱碎裂中，m/z361、346、331、328及300等特征离子表明其裂解行为与M1等化合物类似，因此将M5、M7及M22鉴定为桔红素双去甲基化和羟基化产物。

在正离子扫描模式下，代谢产物M4产生m/z331.081 38，分子式为C17H15O7的准分子离子峰（误差为-1.63×10-6）。其实验相对分子质量较之桔红素少42，推测是由桔红素发生三去甲基化反应生成的。M4主要的二级碎片离子m/z316和m/z301分别是由m/z331连续丢失CH3基团所产生，而m/z298进一步反映其裂解行为与化合物M1、M13等相似，故将M4鉴定为桔红素三去甲基化产物。与M5、M11的鉴定方式相同，可将分子式为C17H15O8的M2和M14鉴定为桔红素三去甲基化与羟基化复合反应产物。

化合物M20和M21的准分子离子峰均为m/z389.123 08 [M＋H]+，推测分子式为C20H21O8，比正离子模式下检测到的桔红素（C20H21O7）多了1个氧原子，推测为桔红素发生了羟基化反应。在其二级质谱图中筛选得到的m/z374、359、341和313等离子碎片进一步证实了上述推断。代谢产物M26产生了m/z403.138 68和分子式为C21H23O8的准分子离子峰（误差为-2.37×10-6）。其相对分子质量比桔红素多30，推测桔红素结构中多了1个甲氧基（-OCH3）。在ESI-MS2质谱图中，m/z403经碰撞诱导碎裂产生m/z388、373（连续丢失CH3）、m/z355（脱去1分子H2O）、m/z327（中性丢失CO），故将M26鉴定为桔红素甲氧基化产物。其二级谱图见图4。

图4 代谢物M26的二级质谱图Fig.4 Secondary mass spectrum of metabolite M26

代谢物M10在6.82 min被洗脱并产生m/z315.122 68的准分子离子峰 [M＋H]+，预测分子式为C18H19O5（误差为-2.00×10-6）。其相对分子质量比桔红素少58，而二级谱图中的特征碎片m/z133表明中性丢失了1分子CO，m/z297、279等产物离子证明其碎裂行为与桔红素类化合物相同，故推测桔红素还脱去了1分子甲氧基（-OCH3）。因此将M10鉴定为桔红素去甲氧基化和脱一氧化碳复合反应产物。其二级谱图见图5。

图5 代谢物M10的二级质谱图Fig.5 Secondary mass spectrum of metabolite M10

3.3 桔红素在大鼠体内的代谢途径分析

通过对比空白组大鼠的血浆、尿液与粪便质谱图，最终从给药组大鼠的生物样品中鉴定出28个代谢产物，其详细代谢途径见图6。综合分析这些代谢物的转化途径，桔红素在大鼠体内主要发生去甲基化、羟基化、硫酸酯化、葡萄糖醛酸化、去甲氧基化、甲氧基化、脱一氧化碳以及它们的复合反应等。

图6 桔红素在大鼠体内的代谢途径Fig.6 Metabolic pathway of tangeretin in rats

4 结论

本研究采用固相萃取法处理大鼠的生物样品（尿液、血浆与粪便），可高效提取其中的代谢产物，使有机溶剂的使用量大大减少、重复性得到进一步优化，且操作简便，避免了多种杂质的干扰。生物样品经纯化后，使用UHPLC-Q-Exactive高分辨质谱联用技术对大鼠体内桔红素的代谢产物进行了全面筛选与快速鉴定，基于桔红素等多甲氧基类黄酮对照品的特征性碎裂行为、通过化合物的精确相对分子质量获取分子式，使误差缩小，鉴定结果更为精确。

结果表明，共从给药组大鼠的生物样品中鉴定出28个代谢产物。其中鉴定得到的M1、M3、M4及M13等代谢物最为常见，而其后发生羟基化反应生成的M2、M5与M11，发生硫酸酯化和葡萄糖醛酸化反应生成的M6、M8和M12进一步剖析了桔红素深层次的代谢轮廓。而M10（脱甲氧基与一氧化碳）与M26（甲氧基化）则对现有极少数有关桔红素的代谢研究作了重要补充。本研究较为详细地剖析了桔红素这一类多甲氧基黄酮的代谢机制和中间过程，可为桔红素下一步的药理活性、药动学、毒理学研究及食品保健药物的开发提供参考，同时可为其他中药天然有效成分的代谢研究提供借鉴。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突