结直肠癌中VASP表达及与转移关系研究

党运芝 于娇 赵淑红 金龙 任晓跃 王青

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是消化道最常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内发病率位列第三，死亡率位列第三［1］。手术切除是CRC最有效的治疗方式，但是复发和转移仍是手术治疗失败的主要原因［2］。另外，约20%的结直肠癌患者在诊断时已出现了转移［3］。尽管近年来CRC治疗方法取得了显著进步，但转移性CRC可选择的有效治疗方式仍较少［4-5］，目前关于CRC转移的机制仍不清楚，亟待进一步研究。VASP是Ena/VASP家族的一个重要成员，可调节actin细胞骨架运动及细胞迁移［6-8］。过表达的VASP可促进多种肿瘤的侵袭和迁移，且与差的预后呈正相关［9-11］。但关于VASP在结直肠癌中的表达和功能报道较少。本研究检测了VASP表达，并分析了VASP表达量与结直肠癌预后的关系。通过体外细胞实验及裸鼠体内实验探索了VASP在CRC转移中的作用。

材料与方法

一、细胞系和人组织标本

人结肠永生化细胞CRL1 790，人结直肠癌细胞系SW480、S1226、DLD-1、RKO、Caco-2、SW620、LoVo、SW48、T84和Colo201引自美国模式菌种细胞库（ATCC），由陕西省人民医院实验室组织细胞库保存。

二、荧光定量PCR

用Takara试剂盒提取新鲜组织的RNA，用Takara试剂盒逆转录成cDNA，后行荧光定量PCR。反应程序如下：95°C，15s；55-60 °C，15s；72°C，15 s共45个循环。用如下公式计算样本的表达量：2–ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCtTumor– ΔCtNontumor）。

VASP的引物序列如下：

正向：5'-ATGGCAACAAGCGATGGCT-3'

反向：5'-CGATGGCACAGTTGATGACCA-3'

三、免疫组化

结肠癌及癌旁组织芯片，65℃烤片3～4 h，常规脱蜡水化，柠檬酸钠（pH=6.0）高压修复2 min，冷却至室温后于3%H2O2封闭15 min。加入VASP（abcam，ab229624）一抗，4℃孵育过夜。第二天PBS漂洗3次×5 min后，滴加二抗，室温孵育30 min。PBS漂洗3次×5 min后，滴加辣根过氧化物酶，室温孵育30 min。PBS漂洗3次×5 min，DAB显色，脱水透明，中性树脂封片。

免疫组化评分由两位病理科医生独立完成，免疫染色强度分为0～3分：0（阴性），1（弱阳性），2（中度阳性），3（强阳性）。细胞阳性率分5个级别：0（阴性），1（1%～25%），2（26%～50%），3（51%～75%），4（76%～100%）。最终得分为免疫染色强度与细胞阳性率的乘积。其中0～3为阴性，4～12分为阳性。

四、蛋白免疫印迹

用中等强度的细胞裂解液（含蛋白酶及磷酸酶抑制剂）提取细胞蛋白，用SDS-PAGE凝胶电泳1.5～2.0 h，转至PVDF膜上（恒压25 V，30 min），10%牛奶室温封闭1 h。一抗VASP（abcam，b229624）孵育，4℃过夜。第二天，TBST漂洗5 min×3次，二抗室温孵育30 min。采用Bio-Rad公司的ChemiDocXRS凝胶成像仪成像。

五、Transwell侵袭和迁移实验

选用corning公司24孔小室（直径为8 μm）。在迁移实验中，5×105细胞种植在无血清的上室内；在侵袭实验中，5×105细胞被种植在无血清且基质胶包被的上室，下室均加入600 μL含20%血清的培养基。24～48 h后分别取出小室，用4%多聚甲醛固定10 min，7%的结晶紫染色10 min，倒置显微镜拍照，分析细胞侵袭和转移的数目。

六、裸鼠尾静脉肺转移实验

BALB/C裸鼠，雄性，4～6周龄，购自北京维通利华公司，饲养在SPF级别动物房中。将相应细胞培养至对数期，收取细胞并计数。将裸鼠随机分组（n=10），每只裸鼠尾静脉注射200 μL细胞悬液（约5×105个细胞），后每周行活体成像，9周后处死全部小鼠。

七、数据分析

采用SPSS 20.0进行数据统计分析，数值均记为平均值±标准差（SD）。数值变量采用Student t检验，分类变量采用卡方（χ2）检验，P＜0.05时认为差异有统计学意义。

结 果

一、VASP高表达与结直肠癌较差的预后相关

我们首先用实时定量PCR方法检测了VASP在20例正常肠上皮组织及110例配对的癌旁及CRC组织中的表达水平，发现VASP的表达水平在CRC组织中较癌旁及正常组织明显升高。进一步分析发现VASP的表达水平在复发CRC（n=59）的表达较没有复发的CRC（n=51）升高更为显著。在转移的CRC（n=53）较无转移CRC（n=45）的升高更为显著（图1A）。在20对配对的标本中，VASP在转移性CRC中的表达明显高于原发性CRC（图1A～1B）我们进一步用免疫组化方法分析了VASP在222对配对CRC组织与癌旁组织中的表达。我们选取了222例均接受手术切除的结直肠癌患者，其中130例患者只接受了手术治疗；60例患者接受了手术+化疗；32例患者接受了手术+放疗+化疗。发现VASP主要为胞质着色，且VASP在CRC中的表达明显高于癌旁（图1C）。VAS与肿瘤大小、肿瘤分化、神经侵犯、淋巴结转移、远处转移、AJCC分期呈正相关（表1）。COX多因素分析表明VASP的表达是结直肠癌患者复发及死亡的独立预测因素之一（表2）。而生存分析发现，过表达的VASP与短的总体生存（χ2=62.4，P＜0.001）及高的复发率呈正相关（χ2=66.9，P＜0.001）（图1D）。

表1 结直肠患者中VASP的表达与临床参数的相关性

表2 VASP的表达是结直肠癌患者复发及死亡的独立预测因素

图1 VASP在结直肠癌中的表达。1A：实时定量PCR方法分析正常肠上皮组织、癌旁及CRC组织中VASP mRNA的表达水平；复发与未复发CRC患者VASP mRNA的表达；转移与未转移CRC患者VASP mRNA的表达；20对配对的正常肠上皮组织、原发CRC及转移CRC中VASP mRNA的表达。1B：IHC检测VASP在20例配对的癌旁，原发性CRC及远处转移CRC的表达情况。1C：IHC染色分析VASP在癌旁及CRC的蛋白表达情况及IHC评分情况。1D：Kaplan-Meier方法分析VASP的表达与复发及生存的关系。低倍镜图中bar值代表250 μm，高倍镜图中bar值为50 μm。*P＜0.05

二、VASP过表达促进CRC细胞的侵袭和迁移

为进一步研究VASP在CRC中的功能，我们首先检测了正常肠上皮、结肠永生化细胞及10种CRC细胞系中VASP的表达，发现SW620细胞中VASP的表达最低，而SW480细胞中VASP的表达最高（图2A）。因此，我们用慢病毒感染的方法建立两个稳定的细胞株：SW480-VASP和SW620-shVASP（图2B）。体外细胞实验发现，与对照组细胞相比，上调VASP表达可促进SW480细胞侵袭和迁移能力，而下调VASP的表达可以抑制SW620细胞的侵袭和迁移（图2C）。

图2 VASP可促进结直肠癌细胞的侵袭和迁移。2A：VASP在正常肠上皮、结肠永生化细胞及10种CRC细胞系中的表达；2B：慢病毒转染后VASP在相应细胞中的表达；2C：Transwell实验分析SW480-VASP，SW620-shVASP与相应对照组细胞的侵袭和迁移能力

三、裸鼠体内实验VASP过表达可促进CRC细胞系的肺转移

为进一步研究VASP在CRC中的功能，我们将SW480-VASP及SW620-shVASP细胞及其相应对照组细胞分别注射到小鼠的尾静脉，并每周成像一次。生物活体成像发现VASP过表达可增加SW480细胞的信号强度，而下调VASP的表达可降低SW620细胞的信号强度（图3A～3B）。HE染色发现VASP过表达可以增加SW480细胞肺脏转移的发生率及转移灶数目，而下调VASP的表达则可以降低SW620细胞肺脏转移的发生率及转移灶数目（图3C～3E）。而生存分析发现VASP过表达可以降低小鼠总体生存时间，而下调VASP的表达则可以延长小鼠总体生存时间（图3F）。

图3 VASP可促进结直肠癌细胞的肺转移。3A：生物发光成像显示各组裸鼠体内转移情况；3B：各组裸鼠尾静脉注射后0～9周活体成像的信号值；3C：各组裸鼠肺部代表性的HE图像；3D：各组裸鼠肺转移发生率；3E：各组裸鼠肺脏转移灶的数目；3F：各组裸鼠的总体生存。*P＜0.05

讨 论

Ena/VASP蛋白是一个保守的actin调节蛋白家族，由EVH1、EVH2和一个富含脯氨酸蛋白的区域组成。近年来的研究表明，VASP在多种肿瘤中亦具有重要作用。在肝细胞癌中，VASP的表达水平明显升高，与门静脉癌栓形成及不良预后呈正相关［12］。肝脏是结肠癌最常见的转移器官，在小鼠肝脏转移模型及肿瘤患者中，结肠癌细胞到达肝窦并上调肝脏星形细胞的VASP表达，VASP促进肝脏星形细胞向肿瘤相关肌成纤维细胞转化［9］。乳腺癌中，Wnt/β-catenin信号通路与VASP形成正反馈环路，促进乳腺癌细胞增殖和转移［13］。在我们前期研究中发现，VASP在肝细胞癌中表达明显升高，转录因子HOXC10通过上调VASP的表达促进肝细胞癌的转移［14］。而食管癌中，VASP的239位点磷酸化则可抑制肿瘤的侵袭和迁移［15］。

临床病理学特征在预测结直肠癌预后，选择合理治疗方案上具有重要作用［16］。但目前关于VASP在结直肠癌中表达报道还较少，且结论相互矛盾。在既往的文献中［17］发现VASP的过表达及磷酸化与CRC疾病的复发呈正相关。另外，在60例结肠癌中VASP的过表达与不良预后呈正相关［18］。但另一篇只有20例CRC的研究中则发现VASP及两种磷酸化VASP的表达水平在癌组织显著低于癌旁组织［19］。本研究通过实时定量PCR及免疫组化染

色的方法发现VASP在CRC中的表达较癌旁明显升高。VASP与AJCC分期及淋巴结转移呈正相关，是CRC患者复发及死亡的独立预测因素之一。另外，在20例配对的样本中，我们发现VASP在转移性CRC组织中的表达显著高于原发CRC组织中的表达，基于此我们对VASP在CRC转移中的作用进行了进一步探索。首先体外细胞Transwell实验发现上调VASP的表达可促进CRC细胞的侵袭和迁移，而下调VASP的表达则可以抑制CRC细胞的侵袭和迁移。体内的裸鼠尾静脉实验中，过表达的VASP可以促进CRC细胞的侵袭和转移，是促进CRC进展的重要分子。

综上，本研究发现VASP在CRC中表达升高与差的预后呈正相关。体内外实验表明VASP可促进CRC的侵袭和转移。本研究明确了VASP在CRC中的表达和功能，为临床治疗CRC转移提供潜在的靶点，但VASP促进CRC转移的机制仍需进一步的研究。