人神经干细胞移植对自身免疫性脑脊髓炎小鼠的疗效

薛金嫚，安文强，张 茜，杨 敏，刘 鹏，郭 迎，吴晓牧

(1.北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司，北京 102600； 2.江西省人民医院神经内科，南昌 330006)

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是中枢神经系统最常见的自身免疫性疾病，导致髓鞘及其少突胶质细胞的破坏，从而留下容易损伤和变性的脱髓鞘轴突，最终导致轴突丧失和永久性神经功能障碍[1-3]。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)与MS的临床症状及病理特征相似，故常用EAE作为MS实验研究的动物模型。目前MS主要使用免疫调节或免疫抑制药物治疗，但药物治疗价格昂贵，且不能从根本上改善疾病进展及患者的运动功能障碍[4]。

干细胞研究的进展为神经退行性疾病的治疗提供了新的策略。神经干细胞移植及其提供的少突胶质细胞替代和介导髓鞘修复的潜能越来越引起研究者关注[5]。人神经干细胞(human neural stem cells，hNSCs)可多谱系分化为神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞，具有自我更新以及多谱系分化的能力[6-7]。因此，hNSCs为中枢神经系统功能重建和神经再生带来希望[4]。近几年，NSCs治疗MS的研究正逐渐增多。目前，关于NSCs治疗MS的研究主要集中在临床前的动物研究且NSCs供体为同种异体动物。例如，GAO等[8]研究发现鼠来源的NSCs能抑制慢性EAE大鼠的脑炎症并改善髓鞘密度。ZHANG等[9]移植诱导多能干细胞来源的NSCs治疗小鼠MS，显著减少了EAE小鼠的T细胞浸润，改善了白质损伤。hNSCs治疗MS的研究仅有国外的2项，且处于临床I期的研究阶段(数据来源ClinicalTrial)。然而，hNSCs治疗MS动物模型的研究较少。本研究以C57BL/6(6N)小鼠为实验对象构建EAE模型，hNSCs鉴定后进行EAE小鼠的移植治疗，观察hNSCs治疗EAE的疗效，以期为临床治疗MS提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

DMEM/F-12培养基、胰酶(TP-EDTA)均购自美国Gibco公司；抗体均购自Abcam公司；苏木精、伊红均购自北京中杉金桥科技有限公司；多因子试剂盒购自Biolegend公司(货号：740446)；hNSCs系来自北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司。

1.1.2 实验动物

健康雌性 C57BL/6(6N) 40只，8～12周龄，体重18～20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006。在SPF级环境下进行小鼠的培养。

1.2 方法

1.2.1 hNSCs的培养

hNSCs复苏后计数，接种于T75培养瓶中，于37 ℃、5% 二氧化碳培养箱中传代、换液培养8～14 d，于倒置荧光显微镜中观察并记录细胞形态[10]。锥虫蓝染色计数法计算hNSCs在第1～10天的细胞数目，然后计算hNSCs代内增殖倍数。

1.2.2 流式细胞术检测hNSCs干性标志物

hNSCs处理后，对其进行膜表面标记、细胞内标记和细胞核标记染色[11]。细胞清洗、固定后，通过流式细胞仪分析检测干性标志物CD133、vimentia、Nestin、Musashi、PAX6、SOX2的表达，于CytExpert软件统计并分析阳性率。

1.2.3 免疫荧光检测hNSCs分化标志物

hNSCs处理后，接种于24孔板中培养并固定，对其进行GFAP、TUJ-1及O4的免疫荧光染色，于倒置荧光显微镜下拍照，photoshop合成图片后用Image-Pro Plus统计阳性细胞数目并计算阳性率[9]。

1.2.4 Transwell法检测神经干细胞的迁移能力

含hNSCs的细胞悬液加在transwell的上室中，并取hNSCs培养基置于下室中，小室放于24孔板中；将24孔板放置于培养箱中，培养14、18、20 和22 h，于倒置显微镜下拍照，photoshop处理图片后用Image-Pro Plus统计迁移细胞数目并计算迁移率[12]。

1.2.5 EAE小鼠模型的建立

选取8～12周龄雌性C57BL/6(6N)小鼠称取体重，确认不同小鼠个体间体重无统计学差异。选取30只小鼠用于建立模型，10只小鼠作为空白对照。将溶于PBS的MOG35-55肽段(每只小鼠600 μg)与完全弗式佐剂(含5 mg·mL-1结核分枝杆菌)等体积充分混匀成油包水乳剂，于小鼠脊柱背侧中线两侧分4点皮下注射(每个部位50 μL)，并于免疫当日和48 h后分别通过腹腔注射百日咳毒素300 ng (溶解于 300 μL PBS)，以进行免疫诱导制备EAE模型。

1.2.6 hNSCs的移植及实验分组

实验分3组：hNSCs治疗组(NSC治疗组)、模型组、空白组，每组10只小鼠。造模10 d后，以出现尾部远端无力作为EAE造模成功的标准，最后造模成功小鼠20只。将培养的hNSCs消化计数，立体定位仪定位到沿中缝向后前囟前后-0.5 mm、中缝向右中缝左右 1 mm、深度颅骨平面向下2.5 mm，于脑室注射10 μL(含2.5×105)细胞。空白组于脑室注射10 μL PBS。

1.2.7 小鼠神经功能评分

自造模日(d0)起每日记录实验小鼠体重、动态观察临床体征并进行神经功能评分，直至细胞移植后14 d。实验动物的评分标准根据TOADER等[13]的5级评分法。0分，无任何临床症状；1分，尾瘫；2分，双后肢无力；3分，双后肢瘫痪；4分，双后肢及部分前肢瘫痪；5分，完全四肢瘫痪或死亡。症状介于两者之间记0.5分。

1.2.8 HE染色

细胞移植14 d后将各组小鼠处死取脑组织，取材后直接放入4%多聚甲醛中固定超过24 h，常规脱水、透明、石蜡包埋并制成石蜡切片。根据步骤说明进行HE染色[14]。于显微镜观察并分析炎性细胞情况。

1.2.9 细胞因子的检测

细胞移植14 d后，利用多因子检测试剂盒检测各组小鼠血清中细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10的水平，严格按照试剂盒操作说明书进行操作。经流式细胞仪分析获得样本中各细胞因子的水平。

1.2.10 统计学方法

使用Graphpad Prism5.0对数据进行处理。计量资料以均数±标准差表示，组内、组间比较均采用t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hNSCs的形态及生长变化

hNSCs培养8～14 d后神经球直径达到200 μm以上，且经过消化后能够稳定传代扩增，其倍增时间为传代后3～4 d。见图1。

2.2 hNSCs干性标志物的表达

流式细胞术结果显示，hNSCs干性标志物Musashi表达阳性率为73.49%；Nestin表达阳性率为97.87%；CD133表达阳性率为80.97%；SOX2表达阳性率为97.66%；vimentia表达阳性率为98.58%；PAX6表达阳性率为91.8%。见图2。

图2 hNSCs干性标志物的表达(流式细胞术)

图2(续)

2.3 hNSCs分化标志物的表达

免疫荧光结果显示，神经元标志物TUJ-1表达的阳性率为60.8%，星形胶质细胞标志物GFAP表达的阳性率为25%，少突胶质细胞标志物O4表达的阳性率为0.4%。见图3。

2.4 hNSCs的迁移能力

Transwell结果显示，hNSCs迁移率在14、18、20 h随着时间增加逐渐增高，20 h迁移率高达43%。见图4。

图4 hNSCs细胞的迁移情况

2.5 各组体重及神经功能的评分

如图5所示，空白组、模型组、NSC治疗组小鼠体重基本相同；模型组小鼠见尾瘫并伴随双后肢无力现象，神经功能评分为1.5，NSC治疗组小鼠仅见尾瘫现象，神经功能评分为1。

2.6 各组的HE染色

HE染色结果显示，与空白组比较，模型组小鼠脑组织中见较多炎症细胞，而经hNSCs治疗后小鼠脑组织炎症细胞数目显著降低。见图6。

图6 各组脑组织的HE染色(箭头所示为炎症细胞)

2.7 各组细胞因子的水平

流式细胞术结果显示，与空白组比较，模型组血清中促炎因子IL-1β、IL-6的水平显著升高(均P<0.05)，IL-10的水平降低(P<0.05)；与模型组比较，NSC治疗组血清中促炎因子IL-1β、IL-6的水平显著降低(均P<0.05)，IL-10的水平升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组血清细胞因子水平的比较

表1 各组血清细胞因子水平的比较

组别nIL-1βIL-6IL-10空白组3182.77±161.99140.3±97.031420.38±961.57模型组3414.83±219.70*581.82±424.54*1017.54±441.00*NSC治疗组3243.68±40.55#339.47±200.42#1620.16±816.39#

*P<0.05与空白组比较；#P<0.05与模型组比较。

3 讨论

MS是一种神经退行性疾病，可导致脱髓鞘并伴有身体或认知功能障碍。多灶性炎症进入中枢神经系统是MS损伤的主要原因[15]。干细胞具有免疫调节和神经保护的潜在作用，是治疗神经退行性疾病的一种有前途的策略。神经干细胞可以调节趋化因子水平，导致免疫细胞向中枢神经系统受损部位迁移[16-17]，这些信号分子对内源性神经干细胞进入白质也很重要[18]。许多动物研究[19-23]表明用动物源神经干细胞治疗多发性硬化是有效的，其有益作用主要由免疫调节和神经保护机制介导。YANG等[24]通过静脉注射同种异体侧脑室外侧壁脑室下区的NSCs和骨髓源NSCs治疗EAE鼠，结果表明二者对EAE鼠具有相同的治疗潜力，但侧脑室外侧壁脑室下区的NSCs存在伦理问题而备受争议，这使骨髓源NSCs成为治疗MS的更优治疗方式。但是骨髓源NSCs来源少且取材不方便，故研究者们[9,25]尝试研究诱导多能干细胞来源的NSCs对MS的可能治疗作用。ZHANG等[9]利用小鼠诱导多能干细胞源NSCs治疗EAE小鼠，结果表明经多能干细胞源NSCs治疗后小鼠中枢神经系统的T细胞浸润大大减少，髓鞘的再形成显著增加，运动功能的恢复也提高了。MCINTYRE等[14]研究发现人胚胎干细胞源的NSCs移植后，调节性T细胞增加，并促进EAE小鼠的再髓鞘化，但是出现了免疫排斥反应。临床上hNSCs治疗MS目前有2项研究，其目的主要为观察其治疗的安全性，但尚处于I期阶段，已激活但尚未招募(数据来源clinicaltrials.gov)。故迄今有关hNSCs治疗MS在临床上的安全性研究尚未报道。

本研究通过注射MOG35-55肽段进行小鼠EAE的诱导，模拟人MS的病理及行为学改变。通过对小鼠行为学评判，本研究成功建立了小鼠EAE模型。进一步通过脑立体定位进行hNSCs脑内移植， 结果显示NSC治疗组、模型组和空白组3组体重基本保持不变，但是NSC治疗组的神经功能得到明显缓解，特别是NSC治疗组体重无明显变化与TOADER等[13]的研究结果一致。本研究结果还显示，经hNSC治疗后小鼠脑组织的炎症细胞浸润减少，同时伴随促炎因子IL-1β、IL-6的含量降低，抗炎因子IL-10的含量增加，提示hNSCs治疗对EAE具有改善作用，这为临床治疗MS提供新的思路和方法。同时，本研究采用多因子方法进行细胞因子表达的检测，解决了小鼠血清含量少的问题。但是，本研究仅探讨了hNSCs在EAE模型中炎症细胞浸润的改善作用，对轴突损伤修复及NSCs移植后体内分化、分布、存活、迁移等情况尚未做深入研究，这些将是笔者未来研究的方向。

综上，本研究通过体外培养鉴定hNSCs，并将其移植至EAE小鼠脑内进行定位治疗，显示hNSCs具有改善EAE小鼠神经功能及炎症浸润的作用，这为其应用于临床MS的治疗提供了实验基础。