经皮无创耳迷走神经刺激对阿霉素所致心脏毒性的保护作用

郭辅定，殷铭，赖燕秋，刘志豪，刘子韩，金晓星，江洪

阿霉素（DOX）是从链霉素菌属中提取的具有抗肿瘤活性的蒽环类抗生素，具有作用广谱、抗瘤效果好等特点，临床广泛用于血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤治疗[1,2]。然而，DOX对心脏具有潜在的毒性作用[3]，可渐进性、不可逆性的导致心肌细胞损伤、死亡，出现心肌病、心力衰竭、心律失常和冠状动脉（冠脉）损伤等多种心血管疾病[4,5]。肿瘤幸存者中，心血管疾病的发病率与死亡率仅次于肿瘤复发[5]，心血管疾病是老年乳腺癌患者首位死因[6]。迷走神经耳缘支是迷走神经在体表的唯一分支，研究表明，低强度耳缘迷走神经刺激（VNS）可显著降低血清白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子水平，改善心功能指标，减轻心肌梗死患者心肌缺血再灌注损伤[7]。此外，VNS可通过抑制炎症反应、减少活性氧（ROS）生成和抑制细胞凋亡，对心肌缺血再灌注损伤发挥保护作用[8]。DOX所致心脏毒性与促炎症因子释放和ROS生成密切相关[9]，然而，目前关于无创耳迷走神经刺激（tVNS）对DOX所致心脏毒性的影响尚不清楚。本研究旨在探讨tVNS对DOX所致心脏毒性的作用及其潜在机制，为临床防治DOX所致心脏毒性提供新型干预策略。

1 材料与方法

1.1 实验动物本研究经武汉大学人民医院动物实验伦理委员会批准。18只健康雄性SD大鼠（180～200 g）由武汉大学实验动物中心提供，分笼饲养于SPF，每日给予充足标准饲料和蒸馏水，适应性饲养1周。

1.2 模型建立18只健康SD大鼠随机分为对照组、DOX组和DOX+tVNS组，每组各6只。对照组腹腔注射等量生理盐水，常规饲养6周。DOX组和DOX+tVNS组腹腔注射DOX（Med Chenm Express公司），采用生理盐水溶解并制备浓度为0.5 mg/ml的DOX溶液，每次5 mg/kg，1/周，共3次，累计剂量15 mg/kg，常规饲养6周。

1.3 tVNS干预将2个鳄鱼夹与电压刺激器（成都锦江，S20)相连，放置于DOX+tVNS组大鼠双侧外耳廓的耳屏内侧，即迷走神经耳缘支。每天6～9 PM给予短暂重复电刺激，刺激设定为2 mA方形波、脉宽0.1 ms、刺激频率20 Hz，每次持续刺激30 min，刺激6周。

1.4 超声心动图检测实验6周后，采用多普勒心脏超声检测三组大鼠左室射血分数（LVEF）、左室收缩末期内径（LVESd）、左室舒张末期内径（LVEDd）、和左室短轴缩短率（LVFS）。LVFS计算公式如下：LVFS =[（LVEDd-LVESd）/LVEDd]× 100%。

1.5 采集血液和组织样本安乐死前，通过腹主动脉采集血样，放入装有凝血剂的真空管中，常温放置1 h，以3000 rpm离心15 min，4℃分离血清，置入-80℃冰箱储存备用。组织标本取自左心室中段心肌用于组织学分析。

1.6 HE染色心肌组织样品置于10%多聚甲醛溶液中固定24 h，在乙醇的递增梯度中依次脱水，在二甲苯中脱蜡，将组织包埋在石蜡中，5 μm厚切片，HE染色。在光学显微镜下观察心肌组织的形态学改变并摄片。

1.7 血清氧化应激相关指标超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量测定将收集的血清样本，按照SOD和MDA检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书中的操作步骤，测定血清中SOD、MDA含量，评估氧化应激水平。

1.8 免疫荧光染色留取各组心肌组织样本，10%多聚甲醛固定，行石蜡包埋、切片，进一步行免疫荧光染色检测心肌组织中促炎症因子IL-1β的表达。激光共聚焦显微镜下观察并采集图像。每张切片随机选取3个区域计数IL-1β，在400倍镜下拍照。研究中使用的主要抗体：抗IL-1β（武汉赛维尔生物科技有限公司）。

1.9 统计学分析采用Graphpad 7.0软件进行分析，计量资料均用平均值±标准误表示。差异采用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 tVNS对DOX所致心脏毒性的保护作用与正常对照组相比，DOX组大鼠LVEF和LVFS均显著减少，LVESd和LVEDd均明显增大（P均＜0.05）。与DOX组相比，DOX+tVNS组大鼠LVEF和LVFS均明显增大，LVESd和LVEDd均明显减少（P均＜0.05，表1）。

表1 各组大鼠心功能比较

2.2 心肌形态学HE染色正常对照组大鼠心肌结构完整，心肌纤维排列整齐，无断裂，细胞间质均匀，无水肿，细胞核清晰。DOX组大鼠心肌纤维紊乱、断裂，可见心肌细胞坏死和大量炎症细胞浸润。DOX+tVNS组大鼠心肌细胞破坏较DOX组明显减轻，心肌纤维无明显断裂，心肌细胞坏死和炎症细胞浸润明显减少（图1）。

图1 tVNS对大鼠心肌病理结构的影响（HE，×400）

2.3 各组大鼠血清SOD和MDA水平比较与对照组比较，DOX组SOD水平降低，MDA水平升高（P＜0.05）；与DOX组比较，DOX+tVNS组SOD水平显著升高，MDA水平显著降低（P＜0.05），图2。

图2 各组大鼠血清SOD和MDA水平比较（与对照组比较，aP＜0.01；与DOX组比较，bP＜0.01）

2.4 各组大鼠心肌细胞IL-1β的免疫荧光表达IL-1β蛋白在对照组和实验组大鼠心肌细胞中均显绿色。IL-1β蛋白在对照组中表达量最少，绿色荧光强度最弱，在DOX组中表达水平显著升高，绿色荧光强度最强（图3A）。与对照组比较，DOX组IL-1β蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与DOX组比较，DOX+tVNS组IL-1β蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）（图3B）。

图3 免疫荧光染色技术检测各组心肌组织中IL-1β的表达（×400）

3 讨论

DOX是临床常用的有效抗肿瘤药，但DOX所致的心脏毒性作用限制其应用。关于DOX所致心脏毒性的机制尚不清楚，现有证据表明，氧化应激及其持续伴随的炎症反应是DOX诱导心脏毒性的共同特征和主要机制[9]。DOX首先蓄积在心肌细胞线粒体上，与心磷脂结合阻碍电子传递链，刺激ROS生成，造成心肌损伤[10]。ROS的积累和氧化损伤与炎症反应活化和心脏抗氧化防御系统紊乱有关[11,12]，DOX通过破坏ROS和抗氧化酶水平的平衡介导心脏毒性[13]。目前，DOX所致心脏毒性尚缺乏有效治疗手段，仍以预防为主。

研究发现，蒽环类药物使用与心脏交感神经系统激活密切相关[14,15]，但目前关于自主神经调控对DOX诱导心脏毒性影响的研究较少。新近专家共识表明，血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂和β受体阻滞剂在经DOX治疗的患者中有潜在的心脏保护作用[16]，作用机制可能与三者均可降低交感神经活性，拮抗交感神经过度激活相关。研究表明，自主神经在维持心脏正常功能中发挥重要作用，心脏自主神经失平衡，尤其是交感神经过度激活参与并介导了恶性室性心律失常、心力衰竭、心肌缺血等多种心血管疾病的发生发展[17-19]。拮抗交感神经过度激活及增强迷走神经活性已成为治疗心血管疾病的方法。Stavrakis等[20]发现低强度VNS可显著降低房颤患者血清炎症因子水平，抑制房颤发生。我们近年研究结果表明，无创VNS可显著降低心肌炎症反应和心肌纤维化程度，抑制再灌注心律失常的发生率和慢性心肌梗死后心室重塑[7,21,22]。VNS发挥心脏保护作用的机制可能与降低炎症因子水平、抑制氧化应激反应和心肌细胞凋亡有关[7,8]。本研究表明，tVNS干预可显著改善大鼠心脏功能，减轻心肌结构损伤，发挥心脏保护作用。

氧化应激是目前已知DOX所致心脏毒性的经典损伤机制，减少ROS生成可显著改善DOX所致心肌损伤[23]。SOD是体内一种重要的抗氧化应激酶，与脂质过氧化终产物MDA一起，可间接反映氧自由基含量和氧化应激损伤程度。SOD活性下降和MDA水平增高与DOX所致的心肌损伤密切相关[24]。既往研究表明，VNS可明显升高SOD活性同时降低MDA水平，提高心肌抗氧化应激能力[8,25]。本研究显示，SOD活性下降和MDA水平增高共同参与了DOX所致心脏毒性，而tVNS可显著逆转SOD和MDA异常改变，减轻DOX对心肌细胞造成的损伤。

持续的炎症反应是DOX所致心脏毒性的重要因素。DOX可促进炎症因子IL-1β的释放，造成心肌细胞损伤[26]。IL-1β是机体重要的促炎性细胞因子，可协同其他炎症因子引发细胞因子风暴。研究表明，VNS能显著抑制免疫炎症反应，降低TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎症因子水平[7]。此外，有研究报道，肿瘤微环境中IL-1β的水平与肿瘤发生及侵袭性密切相关[27]。本研究结果显示，DOX诱导IL-1β的表达水平增高，而tVNS干预可显著降低IL-1β的表达水平，提示tVNS可能在减轻DOX所致心脏毒性的同时发挥抗肿瘤作用。

本研究显示，tVNS能有效减轻DOX所致心脏毒性，改善心脏功能，机制可能通过增强心脏抗氧化能力、抑制氧化应激水平和下调炎症细胞因子。这些结果提示，tVNS有望成为临床防治DOX所致心脏毒性一种潜在的辅助治疗策略。