枯草芽孢杆菌对早熟禾和紫花苜蓿修复镉污染土壤的强化作用

李 琪，邢颖娜，杜逢慧，傅晓文，季 蕾，李天元，王加宁，陈贯虹，郭书海，张 强*

(1.齐鲁工业大学(山东省科学院)生态研究所，山东省应用微生物重点实验室，济南 250013；2.山东山冶环境工程有限公司，济南 250101)

随着现代工农业的快速发展，重金属污染土壤问题已经成为全球范围内的重要环境问题[1-2]。重金属在土壤中不能被降解，表现极强的不可逆性和滞后性；被作物吸收后还会损伤植物组织、抑制作物生长，影响农产品的食用安全；在雨水和风的作用下进入地下水和空气中，并沿生物链累积，严重威胁生态系统和人类健康[3]。镉是毒性最强的重金属元素之一，在人体积累会严重损害人体器官和机能，引发“痛痛病”等多种疾病[4]。

植物修复技术利用能够忍耐和富集某种或多种重金属元素的植物吸收、提取、转化、分解或固定土壤中重金属从而清除或减轻土壤污染[5]。相比传统的客土、钝化、电动修复、化学淋洗等物理化学修复技术，植物修复不破坏土壤结构、生态效益良好且经济有效，具有更为广阔的应用前景[6]。但是，受重金属胁迫的影响，修复植物一般生长较慢、生物量较小、易受天气影响、对重金属的耐性有一定限度等，致使植物修复周期较长、修复效益较低、限制了该技术大规模的应用[7]。

植物与微生物联合修复作为一种强化植物修复技术逐渐成为中外研究的热点[8-9]。已有研究表明多种植物促生菌、根际有益微生物或其他功能菌通过促进固氮溶磷、分泌植物激素和抗生素、产生铁载体等促进寄主植物的生长[10]。不同微生物菌株对不同植物去除重金属能力的影响各不相同。有些研究表明，土壤中的微生物作为一种高表面活性的生物胶体，能够吸附、沉淀、氧化/还原重金属，从而大幅度降低重金属的生物有效性以及对植物的毒性，提高富集植物对重金属的耐受性[11]。这些微生物虽然能够保护修复植物、增加植物生物量，但是却阻碍了植物对重金属的吸收和转移。还有研究表明，微生物通过代谢活动及产物促进重金属的溶解和形态转化，提高重金属在土壤中的活性和生物有效性，利于植物吸收和富集重金属，进而提高植物修复效率[12-13]。

早熟禾和紫花苜蓿是两种生物量大、生长速率快、易于种植、再生能力强的草坪植物，对土壤中重金属有一定的抗性[14-15]。枯草芽孢杆菌是较常见的植物内生菌，具有防治病虫害、提高植物品质的作用[16]。现通过盆栽试验，探究枯草芽孢杆菌联合两种草坪植物(早熟禾、紫花苜蓿)对污染土壤中镉的去除作用，确定联合修复镉污染土壤的可行性，并结合土壤中镉的形态、酶活性以及微生物多样性等物理化学生物性质的改变，揭示枯草芽孢杆菌联合草坪植物修复镉污染土壤的机理，以期为重金属污染场地修复技术制订与实施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 镉负载土

采集山东省科学院设施菜地表层土壤(0～20 cm)，室温风干，过2 mm筛，添加一定浓度的氯化镉溶液，老化培养2个月，最终土壤中总镉浓度为(3.98±0.07)mg/kg。

1.2 草坪植物种子

选择两种常见的草坪植物：早熟禾(肯塔基，美国)和紫花苜蓿(阿尔冈金，加拿大)。种子购自亿丰耀种业公司，均为一年生进口品种，发芽率大于90%。种子先在10%的H2O2中浸泡消毒5 min，再经无菌水冲洗3次，擦干表面水分后用于播种。

1.3 枯草芽孢杆菌悬液制备

枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisTTL1)为山东省科学院生态研究所微生物菌种库中保藏的菌株，吸取100 μL枯草芽孢杆菌悬浮液接种于50 mL高压灭菌的Luria-Bertani液体培养基中，30 ℃，180 r/min 下活化培养48 h。取1 mL活化的枯草芽孢杆菌悬液，接种于100 mL液体培养基中，于 30 ℃，180 r/min 下扩大培养24 h。取10 mL菌悬液在5 000 r/min下离心10 min，弃去上清液，用 10 mmol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀两次以除去残余的培养基。用10 mmol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲溶液稀释为波长600 nm下吸光度为1.0 的菌悬液(菌液浓度约为1×108CFU/mL)备用。

1.4 盆栽试验设计

称取1.50 kg镉负载土于聚乙烯塑料盆(直径16.5 cm，高17.5 cm)中，每盆施磷酸二氢钾0.33 g(P浓度0.05 g/kg，K浓度0.064 g/kg)、尿素0.35 g(N浓度0.108 g/kg)，按照称重法浇水至土壤水分为田间持水量的60%～70%，每盆均匀撒播0.5 g(干重)种子，表面覆盖薄土层，植物生长期间定期按照称重法补充水分。植物发芽一周后，种植早熟禾和紫花苜蓿的盆中在植物根部每周分别添加1次15 mL菌悬液，设置为接种处理KBS和ABS；种植早熟禾和紫花苜蓿的盆中在植物根部每周分别添加1次15 mL经高温灭菌处理的菌悬液，设置为未接种处理K和A。共添加4次，枯草芽孢杆菌总添加浓度为4×109CFU/kg土，此外，设置不种植植物、添加灭菌后菌悬液的空白对照组(CK)，以及不种植植物、添加菌悬液的枯草芽孢杆菌对照组(BS)，每个处理重复3次，具体如表1所示。

表1 植物-微生物联合修复镉污染土壤试验设计

1.5 样品采集与分析

植物样品：植物播种90 d后，先拍松根系周围土壤，然后整株植物连根拔出，抖根法获得植物根际土壤，去离子水清洗植物根部，用滤纸擦干后，测量植物鲜重，于105 ℃干燥箱中杀青30 min，于 75 ℃ 烘干至恒重后称量干重，经粉碎机粉碎、硝酸-微波消解后采用石墨炉原子吸收光谱仪测定植物镉含量。

土壤样品：部分根际新鲜土样分别进行以下分析：采用烘干法测定质量含水率；采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定土壤脲酶活性；采用Illumina HiSeq高通量测序技术(百迈客生物科技有限公司，北京)对土壤样品中细菌的16S rDNA的V3-V4区PCR扩增产物进行测序，并对测序数据进行微生物多样性分析。另一部分根际新鲜土样于室内自然风干后研磨过2 mm筛，经硝酸-高氯酸-氢氟酸电热板消解后采用石墨炉原子吸收光谱仪测定镉含量，采用DTPA(二乙三胺五乙酸)提取法测定土壤有效态镉含量。

BCFCd=cp/cas

(1)

R=cpwdryp/(cbswdrys)×100%

(2)

式中：BCFCd为镉生物富集系数；cp为植物中镉含量；cas为处理后土壤中镉含量；R为土壤总镉去除率；wdryp为植物干重；cbs为处理前土壤总镉含量；wdrys为土壤干重。

1.6 统计分析

采用SPSS 17.0对数据进行统计分析，数据表示为平均值±标准差，P<0.05表示数据具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 接种枯草芽孢杆菌对镉污染土壤中草坪植物生长的影响

图1显示了在草坪植物根部接种枯草芽孢杆菌对两种草坪植物的鲜重和干重的影响。可以看出，生长90 d后收获的紫花苜蓿的鲜重和干重均大于早熟禾，且差异显著，植物含水率为58%～76%。接种枯草芽孢杆菌显著增加了早熟禾和紫花苜蓿的鲜重和干重，其中，早熟禾的鲜重和干重的增加比例分别为65.3%、63.3%，紫花苜蓿的增加比例分别为26.4%、29.5%。关于微生物促进植物生长已有不少文献报道，施加枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌等微生物肥料菌剂能够加速土壤中难溶的氮、磷、钾分解，转变为植物可吸收利用的氮、磷、钾化合物，改善作物的营养状况，增加作物的抗逆性，从而促进植物生长，增加植物生物量[11,16]。

图1 接种枯草芽孢杆菌对镉污染土壤中草坪植物生物量的影响

2.2 接种枯草芽孢杆菌对重金属去除的影响

图2显示了早熟禾和紫花苜蓿两种植物的镉含量和镉总量。可以看出，在根部接种枯草芽孢杆菌后，早熟禾的镉含量降低了8.5%，但是因为早熟禾的干重增加比例更大，早熟禾的镉总量增加49.4%；对于紫花苜蓿来说，接种枯草芽孢杆菌后，镉含量和镉总量分别是未接种的1.8倍和2.4倍。图2说明枯草芽孢杆菌能够抑制早熟禾吸收和转运重金属，但是促进紫花苜蓿吸收和转运重金属，两种植物积累的重金属总量还与植物的生物量有关。

图2 接种枯草芽孢杆菌对草坪植物中镉含量和总量的影响

富集系数是指植物体内某种重金属含量与土壤中该种重金属含量的比值，它反映了植物对某种重金属元素的富集能力，富集系数越大，其富集能力越强。图3显示了两种植物的镉富集系数以及土壤中总镉的去除率。可以看出，早熟禾和紫花苜蓿两种草坪植物的镉富集系数均大于1，说明两种植物均具有镉富集能力。早熟禾的镉富集能力较强，生物富集系数约为11，显著高于紫花苜蓿。接种枯草芽孢杆菌增大了早熟禾的镉富集系数，土壤中镉的去除率增大了49.4%；对于紫花苜蓿，接种枯草芽孢杆菌后的镉富集系数和土壤中镉的去除率分别是未接种的2.0和2.4倍，接种后总镉去除率为22%。说明接种枯草芽孢杆菌能够促进早熟禾和紫花苜蓿从土壤中去除镉，而且对紫花苜蓿的促进作用更强。

图3 接种枯草芽孢杆菌对镉生物富集系数和去除率的影响

土壤重金属的有效性是衡量土壤重金属被植物吸收难易程度的指标，一般采用可被某些无机盐类、弱酸或有机络合物等化学试剂溶液提取的重金属含量表示。采用DTPA浸提剂测定土壤有效态重金属含量，结果如图4所示。相比空白对照组(CK)，污染土壤种植早熟禾(K)和紫花苜蓿(A)后，土壤中有效态镉含量分别降低14.2%和38.5%，是因为试验中两种植物均具有富集镉的能力，优先吸收土壤中的有效态镉。相比CK，未种植植物时接种枯草芽孢杆菌(BS)，土壤中有效态镉含量增加约11.7%，说明枯草芽孢杆菌对土壤中重金属起到活化作用。种植早熟禾时，相比K处理，接种枯草芽孢杆菌(KBS)使土壤中有效态镉含量降低了约25.3%，而且早熟禾体内的镉含量也降低(图2)，说明与早熟禾共存时，枯草芽孢杆菌可能对重金属的抗性作用超过了活化作用，也可能添加枯草芽孢杆菌后，刺激早熟禾产生抑制重金属活性的根系分泌物，降低了镉的有效态含量和生物吸收量。已有研究表明微生物可能通过生物吸附、胞外沉淀、生物转化、生物累积等作用对重金属产生抗性，降低土壤中重金属的生物有效性[11]。种植紫花苜蓿时，相比A处理，接种枯草芽孢杆菌(ABS)后，土壤中有效态镉含量增加约12%，而且紫花苜蓿体内的镉含量也增加(图2)，说明枯草芽孢杆菌与紫花苜蓿共存对土壤中重金属的联合作用表现为活化作用。已有研究表明微生物主要通过代谢活动产生多种酸性代谢产物促进土壤中重金属的溶解，促进重金属由专性吸附态和氧化锰结合态向可交换态和有机结合态转变，增加重金属生物有效性[12-13]。

图4 接种枯草芽孢杆菌对土壤中有效态镉含量和脲酶活性的影响

2.3 接种枯草芽孢杆菌对根际土壤生物性质的影响

土壤酶是评价土壤质量的重要指标之一，主要来自土壤微生物、植物和动物的活体或残体，参与多种土壤生物化学过程[4]。脲酶是一种酰胺酶，可以将酰胺态有机氮化物水解转化为植物可以直接吸收利用的无机氮化物[1]。脲酶的作用是极为专性的，土壤的脲酶活性与土壤的微生物数量、有机质含量、全氮和速效氮含量呈正相关，在一定程度上可以反映土壤的供氮水平与能力[9]。由图4可以看出，相比空白对照组(CK)，重金属污染土壤种植早熟禾(K)显著提高了土壤脲酶活性，种植紫花苜蓿(A)对脲酶活性无显著影响。对于未种植植物的土壤(CK)和仅种植早熟禾(K)或紫花苜蓿(A)的土壤，接种枯草芽孢杆菌的BS、KBS和ABS处理将土壤的脲酶活性分别增加了24.3%、82.2%和48.6%。说明接种枯草芽孢杆菌能够提高土壤肥力，改善土壤的营养条件，促进植物生长，这与图1中显示的植物生物量的增加结果是一致的。

接种枯草芽孢杆菌对土壤微生物多样性的影响结果如图5所示。Alpha多样性分析可研究单个样品内部的物种多样性，其指标包括样品中OUTs(operational taxonomic units)个数、丰富度指数(ACE)、多样性指数(Shannon)和覆盖率(均大于99.9%)等。OTUs即分类操作单元，每个OUT(高于97%相似性水平)对应一个物种。从图5可以看出，接种枯草芽孢杆菌的BS、KBS和ABS处理土壤的OTUs个数分别与未种植植物(CK)、只种植早熟禾(K)和只种植紫花苜蓿(A)土壤的OTUs数无显著差异。ACE衡量物种丰度即物种数量的多少，ACE指数越大，说明样品的物种越丰富。Shannon指数用于衡量物种多样性，Shannon指数值越大，说明样品的物种多样性越高。如图5所示，相比CK，只种植早熟禾(K)的土壤ACE指数增加了9.3%、Shannon指数无显著差异，但是相比K处理，接种枯草芽孢杆菌(KBS)后的土壤ACE指数降低了11.6%、Shannon指数仍无显著差异。说明只种植早熟禾能够提高土壤中微生物的丰富度，但是为早熟禾接种枯草芽孢杆菌后降低了物种丰富度。相比CK，只种植紫花苜蓿(A)的土壤ACE指数降低了18.0%、Shannon指数降低了16.1%，但是相比A处理，接种枯草芽孢杆菌(ABS)后的土壤ACE指数无显著变化、Shannon指数增加了47.0%。说明只种植紫花苜蓿降低了土壤中微生物的丰富度和多样性，但是为紫花苜蓿接种枯草芽孢杆菌后增加了物种多样性，改善了土壤的微生态环境。接种枯草芽孢杆菌对种植早熟禾和紫花苜蓿的土壤中微生物群落组成和结构产生的不同影响可能是对早熟禾(钝化和阻隔)和紫花苜蓿(活化和促进吸收)修复镉污染土壤不同的作用效果的一个重要原因。

图5 接种枯草芽孢杆菌对根际土壤中微生物Alpha多样性指数的影响

3 结论

在生长于镉污染土壤中的早熟禾和紫花苜蓿两种草坪植物的根部土壤中接种枯草芽孢杆菌，考察枯草芽孢杆菌对草坪植物生长、重金属富集、土壤重金属形态、脲酶活性及微生物多样性等性质的影响，研究得出以下结论。

(1)接种枯草芽孢杆菌显著增加镉污染土壤的脲酶活性，提高土壤肥力，改善土壤的营养条件，促进植物生长，早熟禾和紫花苜蓿的鲜重和干重显著增加。

(2)早熟禾和紫花苜蓿均具有富集镉的能力，接种枯草芽孢杆菌能够降低种植早熟禾的土壤中镉的生物有效性，抑制早熟禾吸收和转运重金属，显著降低早熟禾的镉含量，因为早熟禾的干重增加比例更大，所以显著提高土壤中镉的去除率。接种枯草芽孢杆菌显著增加种植紫花苜蓿的土壤中镉的生物有效性，促进紫花苜蓿吸收和富集镉，显著提高土壤中镉的去除率。

(3)接种枯草芽孢杆菌能够改善只种植紫花苜蓿造成的土壤微生态环境破坏，但是却降低了种植早熟禾土壤的微生物丰富度。

总之，虽然接种枯草芽孢杆菌对种植早熟禾(钝化和阻隔)和紫花苜蓿(活化和促进吸收)的土壤中镉存在不同的作用效果，但是均促进了植物的生长，提高了植物对污染土壤中镉的去除率，强化了修复效果，为重金属污染土壤的微生物-植物联合修复技术提供了理论基础和技术支持。