海参肽提高免疫力的功效评价

◎乐卿清，廖翼江，汤桂秋，杨隆河，陈婷婷，陈思谨，蔡 兵

（1.自然资源部第三海洋研究所，福建 厦门 361005；2.肽能九号生物科技有限公司，福建 厦门 361101）

免疫系统可促进特异性免疫和非特异性免疫功能，淋巴细胞是特异性免疫应答的主要细胞群。胸腺属中央淋巴器官，主要功能是确保T 淋巴细胞的产生和成熟，脾脏对抗原发生免疫应答作用。因此淋巴细胞的增殖及淋巴器官的增重都是评价免疫系统的常见方法。巨噬细胞是机体非特异免疫系统的部分，在机体固有和适应性免疫功能中扮演着重要的角色，具有吞噬、杀伤、抗原递呈、分泌生物活性物质和调控机体免疫等多种功能。

海参是“海八珍”之首，深受人们的喜爱，也是常用的馈赠礼品。近几年来对海参肽研究报道非常多，其具有丰富的营养成分和保健功能[1-3]，如可以提高免疫力、抗疲劳、抗肿瘤和延缓衰老等。本实验采取小鼠脾细胞的增殖实验、小鼠巨噬细胞吞噬中性红实验、免疫力低下模型小鼠的淋巴器官增重实验探讨海参肽的生物活性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海参肽，由肽能九号生物科技有限公司提供；细胞色素C、抑肽酶、杆菌肽、甘氨酸三聚体、甘氨酸对照品、氨基酸标准品（AAS18）、脂多糖（LPS）和ConA，美国Sigma-Aldrich 公司；胎牛血清（Hyclone）；1640-RPMIMedium（GIBCO）；PBS缓冲液、HanK’s 液、CKK8 和柠檬酸三钠，北京索来宝科技有限公司；地塞米松磷酸钠，罗恩试剂公司；Balb/c 种小鼠（SPF 级），18～20 g，雄性，动物许可证号：SCXK（沪）2017-0005，上海斯莱克实验动物有限责任公司。

1.2 仪器与设备

AKTA pure 蛋白层析仪，美国GE 公司；Dionex ICS 3000 离子色谱仪，美国Dionex 公司，包括带有在线脱气装置的四元梯度泵，自动进样器，柱温箱；Chiomeleon 6.80 色谱工作站；STERI-CYCLE 二氧化碳培养箱、MEGAFGE 11R Centrifuge 离心机，美国Thermo 公司；Mithras² LB943 酶标仪，德国Berthold公司；SW-CJ-1D 超净工作台，苏州净化设备有限公司；蔡司Axio Imager A2 正置光学显微镜，德国Carl Zeiss AG 公司；AL204 万分之一分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SQP 十万分之一分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；GR60DA 高压灭菌锅，美国Zealway 公司；Milli-Q Reference 超纯水系统，美国密理博公司。

1.3 分子量的测定

1.3.1 色谱条件

色谱柱：SuperdexTM30 Increase 10/300 GL 凝胶柱；色谱条件：流动相：50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液+280 mmol·L-1NaCl+10 mmol·L-1KCl； 流 速：0.5 mL·min-1；检测波长：214 nm；进样量20 μL。

1.3.2 对照品与样品的配制

精密称取对照品适量，置于100 mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，配制成每1 mL 含细胞色素C 5 mg、抑肽酶5 mg、杆菌肽5 mg、甘氨酸三聚体5 mg和甘氨酸20 mg 的对照品溶液；精密称取海参肽适量，置于100 mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，配制成每1 mL 含海参肽5 mg 的溶液。

1.4 海参肽中氨基酸的组成与含量

1.4.1 色谱条件

氨基酸分析柱（AminoPac PA-10，2 mm×250 mm）；氨基酸保护柱（AminoPac PA-10，2 mm×50 mm）；流动相：流动相A 为去离子水，流动相B 为250 mmol·L-1NaOH 溶液，流动相C 为1.0 mmol·L-1NaOAc，进行梯度洗脱，流速0.25 mL·min-1，积分脉冲安培检测器，柱温：30 ℃，进样量为25 μL。

1.4.2 样品的配制

精密称取海参肽样品100 mg 置于消解管中，加入6 mol·L-1盐酸溶液10 mL 于110 ℃下加热水解24 h，放冷转移至100 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，精密吸取1 mL 至100 mL 的容量瓶中，加水稀释至刻度，即得。

1.5 海参肽对巨噬细胞吞噬能力的影响

用含10%胎牛血清的DMEM 培养基培养巨噬细胞（Raw264.7），调整细胞浓度，将其接种于96 孔细胞培养板中，使得细胞浓度为2×104个/孔，然后加入不同浓度海参肽（n=6）。以不加药组为对照。培养24 h 后吸去培养基，用PBS 洗涤多余的培养基，加入0.33%中性红，37 ℃下，5% CO2孵育30 min，PBS 洗净多余中性红，加细胞裂解液（无水乙醇∶冰醋酸＝1∶1，体积比），震荡10～15 mim 后，在酶标仪上540 nm 处测吸光度值，通过吸光值的大小评价样品促进巨噬细胞吞噬中性红能力。

1.6 海参肽对小鼠淋巴细胞增殖的影响

将小鼠脱颈处死，立即置于75%酒精中浸泡5 min，无菌取脾，于PBS 中清洗2 遍，置于盛有4 ℃预冷PBS 的200 目细胞筛中，用5 mL 注射器内芯研磨，研磨后透过细胞筛的即为脾细胞悬液。于1 500 r·min-1，4 ℃离心5 min，弃上清；加入3 mL Tris-NH4Cl 溶液混匀，于1 500 r·min-1，4 ℃离心5 min，弃上清，加入1640RPMI-FBS 液重悬细胞，稍静置，转移上清液到新的离心管，以4×106～5×106个/mL 200 μL/孔铺96 孔板，2 h 后加入海参肽及阳性药ConA 和LPS 处理，46 h 后，以1∶10 的比例加入CCK8（20 μL/200 μL），2h 后检测450 nm 吸光度，620 nm 为参比波长。

1.7 海参肽对地塞米松诱导细胞凋亡的保护作用

同1.6 方法无菌取健康小鼠脾淋巴细胞。分别加入地塞米松（终浓度为10 μmmol·L-1）、海参肽（终浓度为10μg·mL-1）或两者共同培养，对照组加PBS。比较海参肽对地塞米松诱导脾细胞死亡的影响。

1.8 小鼠免疫器官增重实验

体内给药实验动物采用Balb/C 小鼠（雄性，SPF级），每组10 只动物，适应性饲养5 d 后，分成5 组：正常对照组、免疫低下模型组、海参肽低、中及高剂量组（100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、400 mg·kg-1）；免疫低下模型组采用隔日腹腔注射地塞米松，40 mg·kg-1·d-1，连续10 次，建立小鼠免疫低下模型，正常对照组腹腔注射生理盐水。首次腹腔注射地塞米松次日，开始灌胃给海参肽，给药21 d，正常组、模型组给予同体积的水。给药结束后，称小鼠体重，取胸腺及脾称重，计算胸腺及脾脏指数。

2 结果与分析

2.1 分子量的测定

通过与对照品出峰时间比较，经过计算，海参肽的主峰位置为12.63 mL；对应的分子量为1 648 Da。其半峰位置为9.11 mL 和16 mL，对应分子量为10 673 Da和276 Da。海参肽的凝胶色谱图见图1。

图1 海参肽的凝胶色谱图

2.2 海参肽中氨基酸的组成与含量测定

氨基酸含量测定结果显示肽能九号生物科技有限公司制备的海参肽含有的氨基酸种类达到16 种，其中甘氨酸含量最高，实验数据见表1。

表1 海参肽的氨基酸含量结果表

2.3 海参肽对巨噬细胞吞噬能力的影响

海参肽对巨噬细胞吞噬能力的影响结果见表2，从表中可以看出，海参肽在低中高3 个浓度（1～100 μg·mL-1）下，具有显著增强巨噬细胞吞噬中性红的能力，并且具有剂量依赖性，活性比阳性药LPS 强。

表2 海参肽对巨噬细胞Raw264.7 吞噬中性红能力的影响表

2.4 海参肽对小鼠淋巴细胞增殖的影响

表3、表4 的实验数据表明，海参肽单独给药对淋巴细胞的增殖无影响，和丝裂原LPS 及ConA 有协同作用，刺激了小鼠淋巴细胞增殖，与LPS 或ConA相比有统计学意义。

表3 海参肽对B 淋巴细胞增殖的影响表

表4 海参肽对T 淋巴细胞增殖的影响表

2.5 海参肽对地塞米松诱导细胞凋亡的保护作用

表5 实验数据表明，地塞米松能诱导脾细胞的死亡，而海参肽能显著保护地塞米松诱导的细胞死亡。

表5 海参肽对地塞米松诱导小鼠脾细胞死亡的保护作用表

2.6 小鼠免疫器官增重实验

表6 实验数据表明，海参肽在中高两个浓度（200 mg·kg-1、400 mg·kg-1）下，增加了免疫力低下小鼠的胸腺重量，并且具有剂量依赖性。高剂量的海参肽也增加了免疫力低下小鼠的脾脏的重量。

表6 海参肽对小鼠免疫器官的影响表（n=10）

3 结论

氨基酸含量分析表明，肽能九号生物科技有限公司制备的海参肽氨基酸种类丰富，含量充足，甘氨酸含量达到29.71%。有关海参肽的氨基酸含量与功能的关系尚需进一步研究。

采用ConA、LPS 刺激淋巴细胞的增殖是细胞水平评价样品对免疫力影响的经典方法[4]。本文采用了肽能九号公司提供的海参肽样品，首先对LPS 和ConA 诱导的脾淋巴细胞（B 细胞或T 细胞）增殖活性进行了探讨，结果表明海参肽有提高淋巴细胞增殖的作用。

地塞米松是临床上常用的免疫抑制剂，对免疫反应的多个环节有抑制作用[5]。本实验采用地塞米松诱导，建立细胞及小鼠免疫抑制模型。给予地塞米松后，其细胞数量减少，动物的体重、胸腺及脾脏指数均显著降低，有统计学意义。肽能九号生物科技有限公司自提的海参肽对地塞米松诱导的细胞死亡有保护作用，对免疫低下小鼠的胸腺和脾脏有增重的作用。研究提示海参肽可以通过对T 淋巴细胞、B 淋巴细胞的增殖来提高免疫力低下小鼠的免疫功能。

市场上海参肽的复方很多[6-7]，提示肽能九号生物科技有限公司自提的海参肽可以和其他提高免疫力的食品复配，在满足提高免疫力功能的同时，改善口感和风味，有一定的升值空间。