阿奇霉素对铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统exoS和exoU基因表达的影响*

常彦斌，游灵玲，张晓兵

重庆医科大学附属第一医院检验科,重庆 400016

铜绿假单胞菌(PA)是医院内感染和呼吸机相关性肺炎最常见的细菌[1-5]。PAⅢ型分泌系统(T3SS)的发现是细菌致病机制研究的突出进展，其T3SS主要分泌4种毒力蛋白，即胞外酶(Exo)S、ExoT、ExoY、ExoU，细菌通过Ⅲ型分泌系统的导管装置把T3SS毒力因子注入细胞，诱导细胞坏死、凋亡[6-10]。

据报道，群体感应(QS)系统抑制剂能减弱PA的毒力[11]，阿奇霉素能够影响PA的QS系统信号分子[12-13]。本研究中，选择对PA毒力机制更为关键的毒力基因exoS和exoU作为研究对象[14-15]，通过PCR分析细菌T3SS毒力基因exoS和exoU的分布。用K-B纸片法研究细菌耐药情况，选取exoS、exoU阳性株通过RT-PCR方法研究阿奇霉素对铜绿假单胞菌exoS、exoU mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1菌株来源 从本实验室自2010-2019年保存的临床菌株库中随机选择50株PA，其中38株来自痰液，6株来自尿液，5株来自分泌物，1株来自血液。使用VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定系统鉴定所有菌株到种。

1.2抗菌药物药敏试验 通过K-B法测定PA对10种抗菌药物的耐药率。药敏纸片：头孢他啶、头孢吡肟、左氧氟沙星、环丙沙星、阿米卡星、庆大霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、美罗培南均为英国Oxoid公司产品。MH培养基由重庆庞通医疗器械有限公司提供。

1.3exoS、exoU基因检测 以煮沸法制备细菌总DNA。用PCR方法检测exoS、exoU基因。依据exoS(GenBank no.AE004091)和exoU(GenBank no.AAC16023)的完整基因序列，采用Primer 3 Plus在线软件设计引物，引物由上海生工生物公司合成。引物序列见表1。各靶基因PCR扩增体系：10 μmol/L上、下游引物各1.25 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，5×PCR反应缓冲液5 μL，DNA聚合酶 0.25 μL，总反应体积25 μL(其中模板5 μL)，其余用双蒸水补足至25 μL。PCR检测exoS热循环参数：93 ℃预变性5 min，然后93 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR检测exoU热循环参数：93 ℃预变性5 min，然后93 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。对PCR扩增产物进行2.00%琼脂糖凝胶电泳，于紫外凝胶电泳成像仪下观察，并记录结果。

表1 PCR引物序列及预计产物长度

1.4阿奇霉素处理细菌 T3SS毒素诱导培养基[16]：胰蛋白胨(Tryptone) 10 g，酵母浸膏粉(Yeast extract) 5 g，氯化钠(NaCl) 10 g，乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)1.902 g溶于1 L蒸馏水，调节pH值至7.0，高压(1.034×105Pa)灭菌20 min。随机选择exoS、exoU阳性菌株各1株，在LB培养基中37 ℃水浴震荡培养过夜，次日取0.1 mL菌液加入含不同药物浓度的诱导培养基5 mL中37 ℃水浴震荡6～8 h，细菌生长OD600为0.6～1.0，取1.0 mL菌液加入1.5 mL无菌离心管，6 000 r/min离心5 min，收集细菌。

1.5RT-PCR检测exoS、exoU mRNA相对表达水平 细菌总RNA的提取参照EZgeneTMbacterial RNA Kit(Biomiga公司)操作说明进行。RT-PCR试剂盒mRNA selective PCR Kit(特异扩增mRNA)购自TaKaRa公司。依据exoS(GenBank no.AE004091)和exoU(GenBank no.AAC16023)的编码序列，用Primer 3 Plus在线软件设计RT-PCR引物，引物由上海生工生物公司合成。引物序列见表2。

表2 RT-PCR引物序列及预计产物长度

对PCR扩增产物进行2.00%琼脂糖凝胶电泳。将电泳凝胶置于凝胶图像分析系统，照相后，采用Gel-Pro(USA)凝胶图像分析软件分析处理。PCR产物量以积分光密度(IOD)表示扩增产物量，计算各mRNA与16S rRNA的比值，即为该mRNA的相对表达水平。

1.6统计学处理 数据采用SPSS22.0统计软件处理。计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.150株PA临床株exoS、exoU基因的携带情况 PCR检测50株临床分离PA exoS、exoU基因，结果exoS基因检测在573 bp有条带，部分菌株PCR产物的电泳结果见图1，随机选择1株PCR阳性株进行扩增出的测序和比对结果见图3；exoU基因检测在428 bp有条带，部分菌株PCR产物的电泳结果见图2，随机选择1株PCR阳性株进行扩增出的测序和比对结果见图4。50株PA两种毒力基因的分布情况见表3。

表3 50株铜绿假单胞菌两种毒力基因分布(株)

注：M为DNA Marker；1、3、5泳道为exoS基因阳性PA临床株；2、4、6泳道为exoS基因阴性PA临床株。

图3 PA临床株exoS PCR扩增的基因测序和序列比对图

图4 PA临床株exoU PCR扩增的基因测序和序列比对图

2.2exoS与exoU阳性PA临床株对常用抗菌药物耐药情况 用K-B法分析exoS与exoU阳性PA对10种抗菌药物耐药情况，结果见表4。从结果可以看出exoU阳性PA对10种抗菌药物的耐药率均高于exoS阳性株，其中环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 exoS与exoU阳性的两组PA对常用抗菌药物耐药率[n(%)]

注：M为DNA Marker；1、2、3、5、6泳道为exoU基因阴性PA临床株；泳道4为exoU基因阳性PA临床株。

2.3不同浓度阿奇霉素对exoS mRNA相对表达水平的影响 用微量肉汤稀释法测得exoS 基因阳性的PA阿奇霉素最低抑菌浓度(MIC)为64 μg/mL，用0 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL的阿奇霉素作用于exoS基因阳性的PA临床分离株。在实验中未观察到这些浓度的阿奇霉素对细菌生长的影响，通过RT-PCR检测exoS mRNA的相对表达水平，结果显示，exoS mRNA的相对表达水平在阿奇霉素4 μg/mL时最高，当阿奇霉素浓度增加时，exoS mRNA逐渐下降至空白对照水平。见表5。

2.4不同浓度阿奇霉素对exoU mRNA相对表达水平的影响 用微量稀释法测得exoU 基因阳性的PA阿奇霉素MIC为128 μg/mL，用0 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL的阿奇霉素作用于exoU 基因阳性的PA临床分离株。在实验中未观察到这些浓度的阿奇霉素对细菌生长的影响，通过RT-PCR检测exoU基因mRNA相对表达水平，阿奇霉素作用exoU 基因阳性的PA后exoU mRNA表达持续降低。见表5。

表5 不同浓度阿奇霉素作用于exoS基因阳性PA后exoS基因mRNA相对表达水平

3 讨 论

PA是一种在环境中普遍存在的革兰阴性杆菌，是院内感染和呼吸机相关性肺炎最常见病原菌之一，而抗菌药物的使用及滥用使细菌的耐药性逐渐增加，并且由于细菌毒力因子的释放[17]，许多重症肺炎患者只用敏感抗菌药物，所以往往不能改善疾病持续时间和严重程度[18]。随着人们对细菌毒力机制理解的深入，毒力因子逐渐成为治疗细菌感染的新靶位。近几年发现，T3SS广泛存在于PA中，与细菌的毒力机制密切相关。PA T3SS主要分泌4种毒力因子：exoS、exoT、exoU、exoY，通过T3SS的导管装置可将毒力因子转运至宿主细胞的细胞质，麻痹宿主细胞以促进PA感染[19]。PA T3SS 毒力因子介导组织损伤、抑制伤口愈合，对PA的感染至关重要[19]。本文研究了50株PA T3SS毒力基因 exoS和exoU的分布情况，结果显示72.00%菌株携带exoS基因，28.00%的携带exoU基因，无同时携带两种基因的菌株，与文献[20]报道类似。

本研究结果还显示，exoU阳性PA株多为多重耐药菌，比exoS阳性株有更高的耐药性，这可能与exoU阳性株细胞膜上外排泵表达水平更高有关[21-22]。有文献报道，PA exoU阳性对喹诺酮类抗菌药物耐药性明显高于exoS阳性株[21]，这是由于药物靶位gyrA突变和外排泵过表达引起。但本研究中exoU阳性株只有14株，数量上远远少于exoS阳性株的36株，这些数量上的差异是否对本研究结果造成的误差，有待今后增加检测菌株数量后进一步确定。

大环内酯类抗菌药物通常不是抗PA的抗菌药物，然而近年来研究表明，大环内酯类抗菌药物在治疗PA感染的囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病和弥散性全细支气管炎患者中有良好效果[23-24]，其具体机制可能是大环内酯类抗菌药物具有一定的抗炎[25]和抗细菌毒力作用[13]。有研究表明，阿奇霉素是通过抑制lasI/lasR和rhlI/rhlR基因的转录，进一步抑制毒力因子的产生[13,26]。本文通过RT-PCR分析了阿奇霉素对试验菌株毒力基因exoS和exoU mRNA表达的作用，结果表明低浓度阿奇霉素对exoS mRNA的表达有促进作用,阿奇霉素浓度为4 μg/mL时菌株exoS mRNA的相对表达水平最高，随着药物浓度的增加，exoS mRNA的相对表达水平逐渐降低，而阿奇霉素对exoU mRNA的表达有抑制作用。有研究发现，阿奇霉素可以抑制PA大部分毒力基因的表达，并抑制细菌生物膜的形成[13]，但本文研究发现低浓度阿奇霉素具有促进exoS mRNA表达，而抑制exoU mRNA表达的作用，因此，与感染exoS阳性菌株患者相比，阿奇霉素可能对感染exoU阳性株的患者更有益。值得注意的是，低剂量阿奇霉素具有促进PA exoS mRNA表达作用，提示临床针对相应感染患者抗感染治疗时应严格按照规范服用该药，以便快速达到有效浓度，并在有效浓度范围维持足够时间。