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老年哮喘合并肺炎克雷伯菌感染患者毒力基因与病情严重程度的相关性研究*

2021-07-19郝超国郭洪海师旭光

国际检验医学杂志 2021年13期
关键词:毒力菌种哮喘

郝超国,平 慧,郭洪海,师旭光

1.邯郸市人民医院检验科,河北邯郸 056001;2.邯郸市中心医院检验科,河北邯郸 056000;3.邯郸市第一医院检验科,河北邯郸 056002

肺炎克雷伯菌(Kpn)属革兰阴性菌,在医院感染致病菌中位居第二,仅次于大肠埃希菌,其在肠道、呼吸道中可引起泌尿系统、呼吸道感染,具有较强的毒力,致病性强,易在医院暴发流行,危害严重[1-3]。Kpn感染者往往入院率、住院花费增加,住院时间延长,呼吸道感染Kpn是入住重症监护病房的危险因素[4],但Kpn的致病机制尚不明确。有研究显示,Kpn毒力基因种类不同,菌株黏性、抗白细胞吞噬、侵袭等因素不同,疾病状况不同[5-6]。但毒力基因与疾病严重程度之间关系鲜见相关研究。因此,本研究以呼吸道疾病哮喘病为研究疾病,探讨老年哮喘合并Kpn感染患者毒力基因与疾病严重程度关系,为临床提供一定依据,现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年7月至2020年7月邯郸市人民医院收治的373例哮喘患者作为观察组,其中男187例,女186例;年龄61~82岁,平均(70.58±6.86)岁。纳入标准:(1)符合2016年中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制定的支气管哮喘诊断标准[7];(2)年龄≥60岁;(3)首次确诊且未经治疗;(4)资料完整。排除标准:(1)合并其他细菌感染疾病;(2)近1周服用抗菌药物;(3)有家族疾病史。选取同期390例体检健康者作为对照组,其中男195例,女195例;年龄60~83岁,平均(71.08±8.47)岁。两组性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。所有受试对象均签署知情同意书,本研究经邯郸市人民医院伦理委员会审核并通过。

1.2方法

1.2.1菌株鉴定 收集所有受试对象痰液,细菌分离全程采用无菌操作,经DL-96Ⅱ细菌鉴定系统(珠海迪尔生物工程有限公司)鉴定为Kpn,并符合医院感染诊断标准[8]。

1.2.2PCR检测毒力基因情况 对所有哮喘合并Kpn感染阳性患者进行毒力基因检测,复苏菌株接种于哥伦比亚血琼脂平板,于35 ℃、5% CO2条件下培养过夜后,挑取适量菌落置于裂解液中,经煮沸法提取总DNA,用于毒力基因wcaG、rmpA、rmpA2、magA、fimH、mrkD、uge、wabG、aero、iucB、iutA、iroNB、ybtA、kfuBC、ureA、allS的PCR反应。50 μL PCR反应体系:Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)25 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,DNA模板5 μL,ddH2O 18 μL。反应条件:95 ℃ 预变性3 min,95 ℃变性 30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸 60 s,30个循环,72 ℃延伸 10 min。参考文献[9]设计毒力基因引物,引物由宝日医生物技术(北京)有限公司合成。PCR产物采用0.15 g/L的琼脂糖凝胶电泳,100 V恒定电压下电泳100 min后,采用Gel DocTMXR及凝胶成像仪(美国伯乐公司)观察结果。

1.2.3疾病严重程度 参考《支气管哮喘防治指南(2016年版)》中关于哮喘急性发作时疾病严重程度分级标准[7]。轻度:活动时气短,讲话可连续,肺部散在哮鸣音,动脉血氧分压(PaO2)正常、动脉血二氧化碳分压(PaCO2)≤45 mm Hg;中度:稍活动即出现气短现象,讲话时断续,肺部有响亮、弥散哮鸣音,PaO2≥60 mm Hg、PaCO2≤45 mm Hg;重度:休息时即出现气短,讲话单字,焦虑、烦躁,有三凹征,肺部有响亮、弥散哮鸣音,PaO2<60 mm Hg、PaCO2>45 mm Hg;危重:不能讲话,嗜睡或意识模糊,呼吸弱或无,PaO2<60 mm Hg、PaCO2>45 mm Hg、血氧饱和度≤90%。

1.3统计学处理 采用统计学软件SPSS25.0对数据进行处理。计数资料以率或构成比表示,行χ2检验。采用Spearman分析毒力基因与疾病严重程度的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组Kpn检出情况 观察组检出Kpn 175例,感染率为46.92%,对照组检出Kpn 12例,感染率为3.08%,观察组Kpn感染率高于对照组,差异有统计学意义(χ2=198.050,P<0.001)。

2.2哮喘合并Kpn感染患者临床分离菌株毒力基因检出率 复苏从175例哮喘合并Kpn感染患者痰液标本中分离的175株菌种。其中,3株菌种复苏失败,故检测了172株菌种的毒力基因情况。阳性率最高的前5种毒力基因为uge(100.00%)、ureA(90.70%)、magA(88.95%)、ybtA(86.05%)、mrkD(85.47%)。见表1。

表1 哮喘合并Kpn感染患者临床分离菌株毒力基因检出情况

续表1 哮喘合并Kpn感染患者临床分离菌株毒力基因检出情况

2.3毒力基因与病情严重程度的相关性 172例哮喘合并Kpn感染患者中轻度102例,中度42例,重度20例,危重8例。Spearman相关分析显示,毒力基因rmpA、rmpA2、magA与疾病严重程度呈正相关(P<0.05)。见表3。

表3 毒力基因rmpA、rmpA2、magA、fimH、wabG、aero、ybtA、ureA、allS与疾病严重程度的相关性

3 讨 论

Kpn作为机会致病菌,是世界范围内最重要的医院感染病原体之一,其易在医院暴发流行,可引起患者多器官感染,增加死亡风险,威胁患者生命安全[10-12]。Kpn致病的原因可能是多种毒力基因的共同作用。根据类型,Kpn毒力基因可分为荚膜多糖合成和合成调控基因、菌毛合成相关基因、脂多糖相关基因、铁摄取系统相关基因、尿素酶相关基因。本研究结果发现,与健康体检者相比,哮喘患者Kpn感染率较高,提示可能受机体本身和环境等影响,导致哮喘患者更易受Kpn感染,且感染Kpn会加重患者病情,从而影响患者健康。

荚膜多糖合成和合成调控基因为Kpn主要致病因子,可促进生物膜生成,具有抗调理素效应,主要逃避宿主机体的免疫应答过程,增加其抗吞噬能力[13-14]。rmpA、rmpA2均作为编码黏液表型调节因子,且二者具有高度同源性,可参与自身新陈代谢,是增强毒力的铁载体,可与铁摄取系统相关基因气杆菌素iutA等共同作用、相互促进,增强细胞黏性,加重病情[15-16]。有研究显示,通过建立magA突变体可降低菌株血清抵抗和抗吞噬能力,存在magA的菌株侵袭性感染能力更强[17]。本研究结果发现,荚膜多糖合成和合成调控基因magA在Kpn菌种中携带率较高,rmpA、rmpA2、magA与疾病严重程度呈正相关(P<0.05),提示荚膜多糖合成相关基因影响菌种生物膜合成,而不同形态的生物膜表现出黏附性、侵袭性、抗吞噬能力均不相同,rmpA、rmpA2、magA表达可能提高Kpn黏附性、侵袭性、提高抗吞噬能力,从而加重病情,临床上检测荚膜多糖合成和合成调控基因可能反映Kpn致病强度。菌毛合成相关基因影响菌株黏附性,其中黏附因子fimH可使菌毛穿过荚膜向外延伸,促进菌株黏附;脂多糖相关基因可以抵抗机体天然免疫,对宿主有较强的防御作用;铁摄取系统相关基因影响铁离子的摄取,Kpn在生长代谢过程中需要铁离子的参与,在高致病性菌种中表现出特异性[18-19]。本研究结果显示,脂多糖相关基因uge、wabG在Kpn中阳性表达率较高,提示Kpn均对宿主天然免疫的作用较强,菌株之间可能差异性不强。aero、kfuBC在Kpn中可以检测到阳性,可能受样本量影响,铁摄取系统相关基因在本研究中只检测到3种。尿素酶相关基因作为尿酸衍生物,可为Kpn生长提供碳源和氮源,尿素酶相关基因缺失株小鼠中Kpn毒力受到影响[20]。本研究还发现,ureA、allS均在Kpn中部分出现阳性表达,且ureA阳性表达率较高,原因可能为ureA阳性表达为Kpn提供了生长所需碳源和氮源,从而促进Kpn生长,加重其毒力,但Kpn的毒力基因较多,更全面的毒力基因及其表达情况有待进一步研究。

综上所述,毒力基因在哮喘合并Kpn感染患者痰液培养中表现出不同程度的表达,这些毒力基因共同影响Kpn的致病性,但荚膜多糖合成和合成调控基因在与疾病严重程度相关性较强,临床上可以作为一定参考依据。

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