血清胆汁酸亚组分TDCA与脑卒中高危人群发生心脑血管事件的关系

夏鹏 夏骏

脑卒中是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病。脑血管病目前已跃升为国民死亡原因之首，成为我国最为严峻的公共卫生问题之一[1]。胆汁酸在临床上虽然是评价肝胆功能的常用指标，但胆汁酸在体内的代谢和运转与血脂特别是胆固醇代谢有密切联系[2]。已有研究表明，胆汁酸水平高表达是颈动脉出现斑块的高危因素，与脑卒中等心脑血管事件发生有一定相关性。但部分研究结果显示，在冠心病患者中总胆汁酸水平是降低的[3]。这些结果不一致的原因可能是因为目前临床上检测分析的是总胆汁酸水平，忽略了真正发挥作用的胆汁酸亚组分，因此不同胆汁酸亚组分在脑卒中等心脑血管事件发生中的作用值得进一步深入分析。本研究采用质谱技术分析脑卒中高危人群胆汁酸亚组分水平，探讨不同胆汁酸亚组分在心脑血管事件发生中的作用，以及其与临床和实验室指标的关系，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 2013年4至5月，从浙江省人民医院周边街道15 933名＞40岁居民的信息中筛查出脑卒中高危人群835例，失访12例，最终符合标准823例，其中男 350 例，女 473 例，年龄 41～88（68.07±8.51）岁。纳入标准[4]：血脂异常，高血压，糖尿病，心房颤动和（或）心瓣膜病等心脏疾病，运动缺乏（锻炼次数＜3次/周且＜30 min/次），吸烟（吸烟≥1支/d且＞1年者），肥胖或明显超重（BMI≥26 kg/m2），有脑卒中家族史。符合以上≥3个高危因素，或着既往有缺血性卒中患者和（或）短暂性脑缺血发作（transient ischemic attack,TIA）病史者即为脑卒中高危人群。排除标准：严重肝肾疾病、肿瘤、精神疾病和全身性免疫疾病者，在随访期内失访或资料不完整者。该项筛查已得到医院伦理审查委员会批准（批准文号：2020QT357）。

1.2 方法

1.2.1 液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）联用检测血清中胆汁酸亚组分水平 所有受检者均隔夜空腹8 h以上，清晨抽静脉血3.5 ml，分离血清，-20℃保存，检测胆汁酸亚组分脱氧胆酸（deoxycholicacid,DCA）、甘氨脱氧胆酸（glycodeoxycholic acid,GDCA）和牛磺脱氧胆酸（taurodeoxycholic acid,TDCA）水平。

通过内标加入-标准曲线法对胆汁酸进行定量分析检测。标准物质购于美国Sigma公司，标准溶液基质采用经活性炭吸附内源性胆汁酸的血清。6个浓度梯度的标准品通过内标校正后建立标准曲线。LC-MS/MS分析仪使用美国SCIEX液相色谱串联四极杆质谱Triple Quad 4500MD，采用日本岛津UPLC系统进行胆汁酸组分分离，色谱柱为Accucore C18柱（100×2.0 mm，2.6 μm），流动相分别为5 mmol/L乙酸铵水溶液和纯甲醇，流速0.85 ml/min，上样量50 μl，采用梯度洗脱后进入质谱，通过多反应监测（multiple reaction monitoring,MRM）模式进行定量检测。每批检测用双水平质控血清进行严格的室内质控。

1.2.2 临床指标的收集 收集所有入选者身高、体重、腰围，测量收缩压和舒张压。采用颈部血管超声技术检查患者双侧颈总动脉、颈动脉窦、颈内动脉、锁骨下动脉及椎动脉，观察颈动脉狭窄情况。

1.2.3 实验室指标检测 所有入选者空腹12h后于清晨静脉采血3 ml，静置15 min待血浆析出后，3 500 r/min离心10 min分离血清。使用全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特，AU5800）检测 FPG、TC、TG、HDL-C、LDLC、游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）、尿酸（uric acid,UA）、γ谷氨酰转肽酶（gamma-glutamyltransferase,GGT）、同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）、血清胱抑素 C（cystatin C,CysC）、超敏C反应蛋白（high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP）、脂蛋白 a（lipoprotein a,LPa）、小而密低密度脂蛋白（small dense low-density lipoprotein,sdLDL）、脂蛋白相关磷脂酶 A2（lipoprotein-associated phospholipase A2,Lp-PLA2）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）和 α-羟丁酸脱氢酶（α-Hydroxybutyrate Dehydrogenase,αHBDH）。并计算非高密度脂蛋白（nonHDL）含量（计算公式=TC－HDL-C）。按Westgard质控规则，每天用双水平质控血清进行严格的室内质控。使用化学发光分析仪（瑞士罗氏诊断，Cobas8000）检测血清胰岛素水平。

1.2.4 随访 对所有入选者进行电话或门诊随访。随访5年，随访内容：是否发生心脑血管（心脏病和脑卒中）不良事件。心脑血管不良事件定义为因心脏病或脑卒中死亡、非致死性心肌梗死、冠心病、脑卒中入院[5]。根据随访结果分为观察组（发生心脑血管不良事件者）和对照组（未发生心脑血管不良事件者）。根据脑卒中高危人群TDCA水平四分位数（P25=0.01 μmol/L；P50=0.027 μmol/L；P75=0.053 μmol/L）分成 Q1 组（0～＜0.010 μmol/L）、Q2 组（0.010～＜0.027 μmol/L）、Q3 组（0.027～＜0.053 μmol/L）和 Q4 组（≥0.053 μmol/L）。

2 结果

2.1 脑卒中高危人群随访结果 随访5年，发生心脑血管事件者27例（观察组），其中男10例，女17例，年龄 54～86（74.00±6.82）岁；发生冠心病、心肌梗死等心血管疾病10例，发生脑卒中、脑梗死、TIA 17例。选择年龄、性别接近的未发生心脑血管事件者37例（对照组），其中男 13 例，女 24 例，年龄 54～85（68.00±7.92）岁。

2.2 两组胆汁酸亚组分水平比较 见表1。

表1 两组胆汁酸亚组分水平比较（μmol/L）

由表1可见，观察组TDCA水平高于对照组（P＜0.05），GDCA、TDCA和总DCA比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.3 不同TDCA水平脑卒中高危人群发生不良心脑血管事件的风险 见表2。

由表2可见，经过单因素及多因素logistics回归分析，Q4组发生心脑血管事件的风险高于Q1组（P＜0.05）：模型1显示Q4组发生心脑血管事件的风险是Q1组的8.250倍；模型2显示Q4组发生心脑血管事件的风险是Q1组的7.671倍；模型3显示Q4组发生心脑血管事件的风险是Q1组的98.594倍。

表2 不同TDCA水平脑卒中高危人群发生不良心脑血管事件的风险

2.4 TDCA水平与临床和实验室指标的相关性分析 见表3。

由表3可见，TDCA水平与Hcy、胰岛素和GGT均有关（均 P＜0.05）。

表3 TDCA水平与临床和实验室指标的相关性分析

3 讨论

胆汁酸是肝细胞以胆固醇为原料合成并分泌胆汁的一大类胆烷酸的总称，在对脂类物质的消化吸收中发挥了重要的生理意义。随着检测技术的进步，目前能够利用质谱技术对不同疾病或生理状态下多种胆汁酸亚组分进行精确的分析，包括在不同肝胆疾病中的表达情况[6]、在妊娠期胆汁淤积症患者中的表达情况等[7]。

本研究利用质谱技术分析了脑卒中高危人群中胆汁酸亚组分DCA、GDCA和TDCA水平，并比较了发生和未发生心脑血管事件组上述指标的表达情况。研究结果发现TDCA在发生心脑血管事件患者中表达增高；将TDCA根据四分位水平分组，通过建立单因素及多因素logistic回归模型，显示Q4组发生心脑血管事件的风险高于Q1组。结果提示高水平TDCA的脑卒中高危人群更有可能发生心脑血管事件，TDCA的表达与疾病发展有关。

除传统的生理作用外，胆汁酸现在被认为是与细胞膜和核受体同时相互作用的信号分子，有研究表明，通过与这些受体的相互作用，TDCA等可调节自身合成、糖和能量代谢[8]。TDCA的这种表现可能与胆汁酸的亲疏水性有关。胆汁酸分子中既有亲水基团又有疏水基团，因此同时具有亲水性和疏水性。疏水性胆汁酸又称为毒性胆汁酸，疏水性越强的胆汁酸对人体的破坏性越大。疏水性胆汁酸按疏水性排列依次为石胆酸（lithocholiacid,LCA）＞DCA＞鹅脱氧胆酸（chenodeoxycholicacid,CDCA）＞胆酸（cholicacid,CA）＞熊脱氧胆酸（ursodeoxycholic acid,UDCA）[9]。TDCA 是一种疏水性胆汁酸，可以诱导线粒体产生活性氧并转换膜通透性，从而导致线粒体功能紊乱[10]。同时，疏水性胆汁酸还能激活死亡受体以及刺激产生促炎介质[11]。但TDCA等疏水性胆汁酸诱导心脑血管事件发生的具体机制还需进一步研究。

本研究分析了TDCA水平与临床和实验室指标的相关性，结果显示TDCA与Hcy、GGT和胰岛素有一定的相关性。已有研究表明，Hcy高表达是心脑血管疾病的独立危险因素，并且Hcy高表达和高血压在心脑血管疾病中起协同作用[12-13]。GGT能水解谷胱苷肽生成甘氨酸和半胱氨酸，甘氨酸能还原Fe3+并产生大量超氧阴离子，氧化LDL-C生成氧化的LDL-C，最终导致动脉硬化[14]。有研究表明，GGT是急性缺血性脑卒中患者与颈动脉硬化的独立危险因素。TDCA与这些指标的相互作用，共同导致心脑血管事件的发生。

本研究通过对脑卒中高危人群5年的跟踪随访，发现高水平TDCA患者较低水平患者发生心脑血管事件的风险更高，因此TDCA指标需要引起临床医师的关注和重视。本研究在建立logistic回归模型时，样本量对数值的稳定性有一定影响，因此需要后期加大样本量或开展多中心研究进一步分析证实。