鱼类和哺乳类Bcl-2家族蛋白的研究进展

齐志涛 闫 冬 熊 凡 昌鸣先

(1. 江苏科技大学生物技术学院, 镇江 212003; 2. 盐城工学院海洋与生物工程学院, 江苏省海洋滩涂生物化学与生物技术重点建设实验室, 盐城 224051; 3. 中国科学院水生生物研究所淡水生态和生物技术国家重点实验室, 武汉 430072)

Tsujimoto等[1]在1984年首次发现了B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)基因, 该基因位于染色体18q21.33上。在具有染色体t(14; 18)易位的B细胞型滤泡性淋巴瘤细胞中, 其转录受14号染色体上免疫球蛋白位点增强子的影响而大量表达[2,3]。与大多数先前发现的促进细胞增殖的致癌基因不同,Bcl-2基因的过表达可以抑制细胞死亡。随后Vaux等[4]发现Bcl-2基因可以延长小鼠淋巴和骨髓样细胞的存活时间, 之后又进一步证实Bcl-2基因具有抗凋亡的功能。迄今为止, 研究人员已在多种生物中发现了近20种Bcl-2的同源基因[5]。随着对Bcl-2家族蛋白的进一步深入研究, 发现这些蛋白不仅可以调节线粒体外膜的通透性, 通过使包括细胞色素C在内的促凋亡蛋白释放到细胞质中从而引发细胞凋亡[6], 还在内质网中参与对Ca2+调控及参与DNA损伤的修复等众多生理生化反应。可以说,Bcl-2家族蛋白是一类对细胞内多种生命活动进行调节干预的多功能蛋白。然而对Bcl-2蛋白如何行使这些复杂的功能, 及这些不同功能之间是否存在关联目前仍缺少全面的机制认识。

1 Bcl-2家族的分类

Bcl-2基因家族成员是控制真核细胞存活与凋亡平衡的关键调节因子。细胞信号通路失调会导致癌症、自身免疫性疾病和退行性疾病等多种疾病的发生[7]。根据结构和功能的不同, 哺乳类Bcl-2家族可以分为3大类: (1)含有4个Bcl-2的同源结构域(Bcl-2 Homology, BH)即BH1、BH2、BH3和BH4的多域抗凋亡蛋白亚家族, 包括Bcl-2、BclxL、Mcl-1、A1、Bcl-B和Bcl-w; (2)含有BH1-4四个结构域的多域促凋亡蛋白亚家族, 包括Bax、Bak和Bok; (3)只含有BH3结构域的促凋亡蛋白, 即BH3-only亚家族, 包括Bid、Bad、Bmf、Bik、Puma、Noxa、Hrk和Bnip3[5](图 1)。鱼类的Bcl-2家族成员与哺乳动物的大多数相应成员具有结构同源性, 表明Bcl-2家族成员在进化过程中具有保守性。此外, 在鱼类中报道了2个Bcl-2同源基因, 分别命名为Bcl-2-like-10(Nrz)和Bcl-wav(Bcl-water-living vertebrates), 二者均含有BH1-4结构域, 但Nrz归为多域抗凋亡蛋白亚家族成员[8], 而Bcl-wav则为多域促凋亡蛋白亚家族成员[9]。

图1 Bcl-2家族成员的分类Fig. 1 Classification of Bcl-2 family

2 Bcl-2家族蛋白在调控细胞凋亡中的作用

2.1 哺乳动物Bcl-2家族蛋白的细胞凋亡调控

线粒体不仅是细胞和机体的“能量工厂”, 同时还在细胞内钙稳态、细胞周期、细胞凋亡和固有免疫等过程中均发挥重要作用[10]。线粒体外膜通透化(Mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP)是细胞凋亡过程中的关键事件, Bcl-2家族蛋白是MOMP的主要调节者。活化的抗凋亡Bcl-2家族成员(如Bcl-2和Bcl-xL)能够维持线粒体外膜(Outer mitochondrial membrane, OMM)的完整性[11]; 而活化的促凋亡Bcl-2家族成员(如Bak和Bax)可以在OMM上形成蛋白脂孔[12]。

在正常细胞中, Bax主要分布在胞质溶胶(Cytosol)中。胞质溶胶中游离的Bax在受到凋亡信号刺激后会转位到OMM上, 通过与OMM的通透性转换孔(Mitochondrial permeability transition pore,MPTP)的相互作用而促进Bax和Bak在OMM上的聚集, 进而调节OMM的通透性, 这是线粒体凋亡途径的关键步骤[13]。当细胞受到DNA损伤、生长因子缺陷或其他凋亡刺激时, Bax和Bak发生寡聚化, 形成寡聚复合物[14]。Bax和BH3-only蛋白从胞浆中转位到OMM上, 使OMM的通透性发生改变, 最终导致线粒体外膜通透化[15]。线粒体释放细胞色素C(Cytochrome C)、凋亡调节因子Smac(Second mitochondria-derived activator of caspases)、丝氨酸蛋白酶HtrA2(High-temperature requirement A2)及凋亡诱导因子(Apoptosis inducing factor, AIF)等促凋亡物质进入细胞质, 解除了凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)对半胱氨酸蛋白酶(Caspases)的抑制作用[16]。此时线粒体释放细胞色素C促进凋亡蛋白酶活化因子(Apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1)寡聚化, 进而与Caspase-9结合形成凋亡小体[17]; 活化后的Caspase-9激活下游Caspase级联反应, 使下游的Caspase-3、-6和-7及核酸酶等裂解和激活; 随之维持细胞生存的蛋白质和核酸被降解, 最终导致细胞凋亡。

2.2 鱼类Bcl-2家族蛋白的细胞凋亡调控

目前, 关于鱼类Bcl-2家族蛋白参与细胞凋亡调控的研究相对较少。已有研究发现, 斑马鱼(Dario rerio)肝脏上皮细胞(Zebrafish liver epithelium, ZLE)感染传染性胰腺坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)后, IPNV可以下调抗凋亡蛋白Mcl-1的表达, 并诱导OMM通透化。其中, IPNV病毒的衣壳蛋白VP3可以上调斑马鱼促凋亡蛋白Bad的表达; VP3也可改变线粒体功能, 导致线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)丢失并激活凋亡起始因子Caspase-9和效应因子Caspase-3, 从而引发细胞凋亡[18]。过表达斑马鱼抗凋亡Bcl-xL基因, 可以阻断IPNV诱导的MMP丢失和线粒体裂解, 阻止了IPNV诱导的细胞死亡而提高宿主细胞的生存能力[19]。此外, 还有研究发现IPNV感染斑马鱼成纤维细胞(Zebrafish fibroblast cell line, ZF4 cells)可通过上调肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)的表达来调节Bad/Bid介导的细胞凋亡和RIP1/ROS介导的细胞坏死途径[20]。斑马鱼Bcl-2同源物Nrz是一个线粒体蛋白, 其在斑马鱼体内的敲降能诱导凋亡[8]。此外, Nrz能够抑制斑马鱼Bcl-2相关蛋白Bcl-wav过表达所诱导的凋亡反应[21]。在石斑鱼鳍条细胞(Grouper fin cells, GF-1)中, 巨型海鲈虹彩病毒(Giant sea perch iridovirus, GSIV)的丝氨酸/苏氨酸(Serine/threonine, ST)激酶能诱导促凋亡蛋白Bax介导的细胞死亡; 过表达抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL能抑制ST激酶诱导的细胞死亡、阻止caspase-9和-3的激活。此外, Bcl-2和Bcl-xL可以通过与促凋亡蛋白Bax的相互作用阻止线粒体释放细胞色素C, 并能阻止GSIV病毒的ST激酶诱导的细胞凋亡[22]。上述研究表明Bcl-2家族蛋白在鱼类细胞凋亡中发挥重要作用, 但确切作用机制有待更多深入研究。

3 Bcl-2家族蛋白在内质网Ca2+调控中的作用

3.1 哺乳动物Bcl-2家族蛋白在内质网Ca2+调控中的作用

内质网(Endoplasmic Reticulum)是细胞内调节Ca2+动态平衡的主要细胞器。在静息的生理状态下, 细胞内Ca2+主要储存在内质网内。内质网主要是通过蓝尼丁受体(Ryanodine Receptor, RyR)和三磷酸肌醇受体(Inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor,IP3R)通道将内质网腔内的Ca2+释放入胞质, 通过钙泵将胞内的Ca2+泵入内质网腔中, 从而维持内质网Ca2+稳态[23]。当内质网受到病原感染、组织缺血、缺氧或生长因子缺乏等刺激时, 内质网内的Ca2+稳态被打破, 大量的Ca2+外流进入胞质和线粒体内。一方面影响线粒体和Bcl-2家族蛋白的活性, 使细胞走向凋亡; 另一方面激活胞内的中性半胱氨酸内肽酶Calpain, 活化的Calpain可能通过激活Caspase级联反应进而影响细胞凋亡。

抗凋亡Bcl-2家族成员可通过与IP3R结合来调节内质网中钙离子的浓度[24]。Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1分别与IP3R的第六个跨膜结构域结合, 这种相互作用抑制了内质网中的Ca2+的过度释放[25]。此外, Bcl-2还通过其BH4结构域与IP3R调节区的中部结合, 从而抑制了由内质网应激引起的Ca2+的大量释放。肌浆/内质网钙离子-ATP酶(Sarco/endo plasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)泵是内质网Ca2+传送的主要通道, 又称之为钙离子膜通道钙泵,其主要功能是保持内质网管腔内Ca2+的浓度高于周围的细胞质中Ca2+的水平[26]。除IP3R外, Bcl-2能结合并失活SERCA泵。在非应激时, Bcl-2与SERCA泵结合并使其失活, 从而阻断Ca2+从内质网流入胞质, 进而阻止细胞发生凋亡, 提示细胞凋亡与钙离子从内质网流入胞浆这一过程相关[27]。

促凋亡Bcl-2家族成员也与IP3R介导的钙调节有关。Bak和Bax缺失会引起IP3R1的钙泄漏增加,从而导致内质网中Ca2+浓度降低, 线粒体中钙吸收量降低[28—30]。Bax和Bak并不直接与IP3R结合, 而是通过与抗凋亡蛋白的相互作用来竞争抗凋亡蛋白与IP3R的结合, 在内质网应激时可激活内质网源性转录因子CHOP(C/EBP homologous protein)和CJun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinases, JNKs)[31]。此时的CHOP和JNK可以发挥削弱Bcl-2的抗凋亡能力的作用, 从而诱导内质网膜上Bax和Bak构象发生变化并寡聚化, 最终导致内质网膜的完整性遭到破坏和Ca2+的外流。当Ca2+从内质网中被释放入胞浆后会激活内质网附近的钙调蛋白分解酶。钙调蛋白分解酶通过作用于caspase-12使其活化并进入胞浆, 诱发caspase的酶联反应; 或是将前凋亡蛋白Bad去磷酸化, 使Bad与其抑制蛋白解离并转移到线粒体上。最终过高的Ca2+浓度会诱导线粒体通透性转换孔打开, 细胞色素C释放, 从而引发凋亡(图 2)。

图2 哺乳动物Bcl-2家族蛋白对内质网钙稳态的调节Fig. 2 The regulation of mammalian Bcl-2 family on the calcium homeostasis of endoplasmic reticulum

3.2 鱼类Bcl-2家族蛋白在内质网Ca2+调控中的作用

Bcl-2同源物Nrz蛋白在斑马鱼的发育中具有一定作用, 该蛋白主要定位于卵黄合胞层(Yolk syncytical layer, YSL), 这是一个含有大量线粒体和内质网膜的区域[32]。研究发现, 敲除Nrz基因可以使卵黄细胞中游离Ca2+增加, 激活肌球蛋白轻链激酶,边缘肌动蛋白肌球蛋白索过早收缩, 卵裂球与卵黄细胞分离, 导致胚胎在原肠胚形成之前发育停滞[33]。在YSL中, Nrz通过与IP3R1 Ca2+通道直接相互作用阻止Ca2+从内质网释放[34]。上述研究表明鱼类Bcl-2家族成员不仅能够调控细胞凋亡, 还可以通过胚胎内的Ca2+作用于细胞骨架动力学从而参与胚胎的早期发育。

Roca等[35]在感染海洋分枝杆菌(Mycobacterium marinum)或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的斑马鱼中发现, 过量的TNF通过产生线粒体活性氧(Reactive oxygen species, ROS)和参与组成线粒体通透性转换孔的亲环素D(Cyclophilin D,CypD), 触发感染巨噬细胞的程序性坏死。巨噬细胞坏死是感染分枝杆菌的一个标志性结果。线粒体ROS诱导溶酶体神经酰胺的产生, 溶酶体神经酰胺能激活组织蛋白B(Cathepsin B)或者组织蛋白D,进一步活化Bid, 最终激活胞浆蛋白Bax[36]。Bax可以通过RyR促进Ca2+从内质网流向线粒体, 导致线粒体钙超载进而引发由CypD介导的细胞坏死, 即分枝杆菌的感染可以诱导TNF通过线粒体-溶酶体-内质网回路介导巨噬细胞的程序性死亡[37]。

4 Bcl-2家族蛋白对DNA损伤的调控

4.1 哺乳动物Bcl-2家族蛋白对DNA损伤的调控

DNA存储着真核生物赖以生存和繁衍的遗传信息, 然而DNA分子本身会发生一些自发性的损伤。当DNA受到损伤时, 细胞将激活一个能够修复和延续其正常生命周期的生存系统。当DNA损伤严重到不可修复时, 细胞将通过细胞周期的停滞和细胞凋亡等一系列反应可以避免受损细胞的大量增殖, 使基因组的稳定性得以维持[38]。毛细血管扩张共济失调突变基因(Ataxia-telangiectasia mutated,ATM)是启动细胞周期调控点所必须的。当ATM感受到DNA损伤信号时, 由惰性二聚体发生自磷酸化成为活性单体; 活化的ATM可以使下游底物发生广泛磷酸化。这些下游反应的底物中就包含有Bid[39]。

一系列研究显示DNA损伤导致ATM激酶迅速将Bid磷酸化, 而非磷酸化Bid突变体的表达则使细胞周期受到阻滞并增加细胞凋亡。在Bid基因敲除的小鼠中, 造血干细胞(Haemopoietic stem cell, HSC)细胞周期提前, 凋亡水平显著增加, 并进一步导致小鼠对辐射的全身过敏[40]。线粒体载体同源物2(Mitochondrial carrier 2, MTCH2)是造血干细胞ATM-Bid途径中线粒体ROS代谢的调节剂[41,42]。MTCH2是位于Bid下游的线粒体氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation, OXPHOS)的负调节因子, 其缺失会提高线粒体OXPHOS的水平。此外, 也有研究显示Bid是造血干细胞中由DNA损伤诱导的线粒体ROS反应的关键调节因子。Bid可通过ATR (Ataxia-telangiectasia mutated-and Rad3-related)激酶应对由复制过程引起的DNA损伤[43];Bid也可作用于DNA损伤传感器复合体(ATR/ATRIP/RPA), 放大细胞对由ATR介导的复制性DNA损伤反应[44]。这些研究表明Bid在DNA损伤修复过程中起着重要作用。

除了Bid外, Bcl-xL和Puma也参与对DNA损伤的调控。Bcl-xL在人细胞中的异位表达能增强DNA双链断裂时同源介导的DNA修复(Homology direct repair, HDR)[45]。在小鼠受到辐射的相同情况下, 与野生型相比,Puma缺失型小鼠的HSCs能更好地维持在静息状态, 并可以进行更有效的DNA修复[46]; 在Puma缺失的诱导多能干细胞中, 较少出现DNA损伤及染色体不稳定的现象[47];Puma基因也是p53诱导成体干细胞凋亡的关键因子, 并在p53启动的DNA损伤细胞死亡中起着关键作用[48]。

4.2 鱼类Bcl-2家族蛋白对DNA损伤的调控

研究发现, 当虹鳟(Oncorhynchus mykiss)受精卵中的DNA修复被抑制后, 胚胎对遗传毒性的损伤具有耐受性[49]。鱼类胚胎发育对父本DNA损伤表现出高度的耐受性, 即使胚胎具有高度的基因组损伤, 也能够发育到孵化阶段。在DNA修复能力有缺陷的虹鳟胚胎中, 凋亡活性下调, 这表明鱼类对DNA损伤的耐受机制可以被激活。在精子受损的斑马鱼胚胎中发现囊胚中期的DNA修复活性增强,后期恢复至基础水平, 孵化出畸形幼鱼的比例较高。畸形幼鱼中DNA损伤后的修复被激活、下游促凋亡因子Noxa表达下调、抗凋亡基因Bcl-2表达上调、触发抑制性凋亡, 这使得胚胎不受父系DNA损伤的影响而存活下来[50]。

5 BCL-2家族蛋白在自噬调控中的作用

5.1 哺乳动物Bcl-2家族蛋白在自噬调控中的作用

细胞自噬是真核生物对细胞内物质进行循环周转的重要代谢过程。其中, 巨自噬(以下简称自噬)是指从内质网中脱落的双层膜将底物包裹形成自噬小泡并与溶酶体融合, 在一系列水解酶的作用下将底物降解的过程。自噬基因Beclin-1(也称为ATG6)通过调节细胞自噬从而在肿瘤的发生和发展中起着重要作用[51]。Beclin-1具有BH3结构域,因此Bcl-2家族蛋白Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1均可以与Beclin-1结合, 阻止Beclin-1形成起始复合物, 进而抑制自噬[52](图 3a)。此外, 内质网上的营养缺乏自噬因子NAF-1(Nutrient-deprivation autophagy factor-1)可以稳定Beclin-1/Bcl-2复合物之间的相互作用[53]。当细胞受到自噬信号刺激时,JNK1可以将Bcl-2上的三个残基Thr69, Ser70和Ser87磷酸化[54], 从而导致Beclin-1从复合物中解离并引发自噬(图 3b)。事实上, 当JNK1磷酸化Bcl-2受到抑制时, Bcl-2对Beclin-1的亲和力增加[55], 并且可以减弱由运动或饥饿引发的自噬。BH3-only亚家族蛋白中的Bad、Bik、Bnip3和Noax及BH3类似蛋白(如ABT-737)可以通过竞争性结合抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL等, 使Bcl-2/Bcl-xL从与Beclin-1所形成的复合物中解聚而促发自噬(图 3c)。与大多数BH3-only亚家族蛋白促自噬机制不同的是, Bim可以通过直接结合Beclin-1并将其与动力蛋白轻链1(Dynein light chain 1, DYNLL1)螯合来抑制自噬[56,57]。由于营养缺乏, JNK将Bim磷酸化, 导致Beclin-1与动力蛋白轻链之间的作用减弱, Beclin-1得以释放并启动自噬[58](图 3d)。

图3 哺乳动物Bcl-2家族蛋白在自噬调控中的作用Fig. 3 The role of mammalian Bcl-2 proteins in autophagy regulation

5.2 鱼类Bcl-2家族蛋白在自噬调控中的作用

肿瘤抑制因子p53可以促进细胞凋亡[59]。斑马鱼p53可以通过直接结合到p53应答元件结构域上招募辅抑制物mSin3a到Bnip3的启动子, 从而抑制Bnip3的表达。在缺氧条件下,p53突变的斑马鱼胚胎中Bnip3的表达上调, 导致p53突变胚胎的细胞死亡率增加; 在Bnip3与p53共转染细胞后, 细胞自噬明显降低。这表明p53通过抑制Bnip3从而对缺氧诱导的细胞死亡具有保护作用[60]。

6 BCL-2家族蛋白在葡萄糖和脂代谢中的作用

6.1 哺乳动物Bcl-2家族蛋白在葡萄糖和脂代谢中的作用

线粒体是细胞新陈代谢的中心。Bcl-2家族蛋白是线粒体凋亡的关键调节分子, 其可通过改变线粒体内外膜的通透性对细胞凋亡进行调控。科研人员推测Bcl-2家族蛋白也具有调节新陈代谢的作用。Danial等[61,62]发现BH3-only亚家族的Bad蛋白可驻留在一个含有葡萄糖激酶的复合物中, 并且该复合物可以调节由葡萄糖所驱动的线粒体的呼吸作用。使用具有靶向葡萄糖激酶的Bad-BH3肽证实Bad可以促进β细胞的存活并持续释放胰岛素以应对葡萄糖的刺激。此外, 磷酸化的Bad可改善糖尿病、胰岛素抵抗、瘦素抵抗及高脂饮食模型中的血糖水平, 并使糖尿病患者的功能性β细胞群得以恢复。Bad的代谢作用也与神经系统有关, 对于调节神经元兴奋和癫痫发作反应至关重要[63,64]。

除了Bad, Bcl-2家族的其他成员也参与了机体的代谢反应。BH3-only亚家族的Noxa被证明可以刺激葡萄糖的消耗, 并且似乎可以通过戊糖磷酸途径而不是糖酵解途径提高葡萄糖的转化率[65]。BH3-only亚家族的Bnip3被证实参与线粒体自噬和脂质代谢。Bnip3基因敲除可以引发肝脏脂肪合成量的增加、脂肪酸氧化(Fatty acid oxidation, FAO)减少及在禁食期间机体无法增加肝脏葡萄糖的产生等[66]。BH3-only亚家族的Bid通过抑制肉碱棕榈醇转移酶-1(Carnitine palmitoyl transferase-1, CPT-1), 进而抑制FAO参与脂代谢。肌肉中缺乏MTCH2(Bid受体)的小鼠, 可以避免由饮食引起的肥胖和高胰岛素血症; 同时也会增加肌肉中线粒体的氧化磷酸化, 引发肌纤维由糖酵解型转化为氧化型, 提高耐力和体力, 并且提升心脏的功能[67,68]。

6.2 鱼类Bcl-2家族蛋白在葡萄糖和脂代谢中的作用

棕榈酸(Palmitic acid, PA)属于饱和脂肪酸, 在各种组织中能引起炎症和细胞损伤。研究发现, 用富含棕榈酸的饲料喂养斑马鱼会导致肝脏脂肪变性和肝损伤。PA喂养组的肝脏显示出与氧化应激和内质网应激反应相关的基因表达增加[69], 这些基因包括激活转录因子4(Activating transcription factor 4, ATF 4)、激活转录因子6(Activating transcription factor 6, ATF 6)、DNA损伤诱导转录因子3(DNA damage-inducible transcript 3, DDIT 3)、内质网降解增强子、甘露糖苷酶α样1(ER degradation enhancer, mannosidase alpha-like 1, EDEM 1)及Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bim、Bida和Bax等。鱼类Bcl-2家族蛋白在葡萄糖和脂代谢中的直接相关作用未见相关报道。

7 展望

在哺乳动物中的研究表明, 大多数Bcl-2家族蛋白定位于细胞质中, 少部分定位于细胞核或者线粒体、线粒体内膜和内质网等细胞器, 在机体新陈代谢、细胞凋亡、自噬和肿瘤发生等过程中发挥着至关重要的作用。鱼类作为最古老的脊椎动物, 种类繁多。当前, 在鱼类中开展Bcl-2家族蛋白功能和作用机制的研究多参照哺乳类中的相关工作进行。但由于鱼类种属之间差异较大以及有的鱼类如鲑科和鲤科鱼类出现全基因组复制现象, 导致不同鱼类Bcl-2家族成员组成不尽相同。因此, 揭示不同鱼类Bcl-2家族成员的组成、Bcl-2家族不同成员介导的信号通路及其作用机制将是今后的研究重点。此外, Bcl-2家族成员在机体免疫反应调控, 尤其是抵制病原微生物入侵方面的研究较少。我们已有的研究结果表明, Bcl-2家族成员参与了鱼类抗菌和抗病毒免疫调控。因此, Bcl-2家族成员在病原微生物入侵过程中的作用也是未来研究的重要方向。