通过式固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中多种受体激动剂药物残留

李艳明，王 坤，朱富强，高会兰

（1.滨州市检验检测中心，山东滨州 256600；2.滨州市职业学院，山东滨州 256603）

受体激动剂目前主要是指α2-受体激动剂和β2-受体激动剂，俗称“瘦肉精”。α2-受体激动剂中的可乐定（Clonidine）是一种肾上腺素能，位于中枢神经系统，其在动物上有促进生长的作用。王雷杰等[1]在饲料中添加可乐定发现，猪的瘦肉率明显提高，眼肌面积增加，脂肪比率降低，背膘厚度减少。α2-受体激动剂除可乐定还包括替扎尼定、安普乐定、溴莫尼定、赛拉嗪等物质[2]。赛庚啶（Cyproheptadine）属H1型抗过敏性药物，可以用于治疗荨麻疹等疾病，并有抗5-羟色胺及抗胆碱的作用，可以使机体中枢神经兴奋，降低饱腹感，增加食量和体重[2]。β2-受体激动剂是一种肾上腺素的受体激动剂，其主要用途是防治支气管哮喘。牲畜体使用后，能够改变其体内代谢的方式，促进肌肉生长，并且可以快速转化脂肪和分解脂肪，促进合成骨骼肌蛋白，最终达到提高牲畜瘦肉率的目的[3−6]。常见的β2-受体激动剂有盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等[7−9]。这些种类的“瘦肉精”，进入机体，可能会导致其出现头晕心悸等中毒反应，甚至死亡[10−12]，目前已经禁止在养殖的食用动物中使用受体激动剂[13]。

α2-受体激动剂因其在动物养殖方面的非法添加可能造成安全隐患，我国农业部的第1519 号公告[14]中明确规定，可乐定与赛庚啶禁止在饲料和动物饮用水中使用。我国农业部公告176 号[15]、193 号[16]、1519 号[14]，对禁止在食用动物饲料添加相关的β2-受体激动剂也进行了说明。目前对于α2-受体激动剂在动物组织中的研究较少，Fan 等[17]利用QuEChERS的方法，超高效液相色谱串联质谱的技术，检测可乐定与赛庚啶在猪肉、猪肝和猪肾的残留。β2-受体激动剂研究的比较多也比较成熟，检测技术也得到了飞快发展[18−20]，包括气相色谱串联质谱法[21]，液相色谱串联质谱法[22−24]，其中液相色谱串联质谱法应用的较多。国家标准GB 31660.6-2019[25]与GB/T 22286-2008[26]分别规定了α2-受体激动剂和β2-受体激动剂的检测方法。离子交换固相萃取小柱（SPE）是目前采用的净化方式，α2-受体激动剂和β2-受体激动剂是不同的检验方法，但均采用SPE 进行净化。SPE 需要活化，上样，淋洗，洗脱4 个步骤，才能达到净化的目的，方法费时，操作繁琐，试剂耗材大量消耗[27−28]。为浓缩样品及避免溶剂效应，将SPE 净化后的样品旋蒸或者氮吹，一批样品旋蒸或者氮吹都会消耗近1 h的时间，并且氮吹时可能会带来交叉污染等各种不确定因素，前处理需要花费大量的时间。

通过式固相萃取小柱，无需活化，直接上样并接收，即可达到去除基质的目的，净化效果显著。目前没有将通过式固相萃取小柱运用到多种类受体激动剂的同时检测当中的相关报道。本文采用通过式固相萃取小柱，对猪肉中的α2型、β2型、H1型等11 种受体激动剂进行同时检测，该方法可以运用到猪肉受体激动剂的风险监测样品及突发事件的及时处置当中。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪肉 在本市随机选取小型市场与市集10 个，每个市场选取3 个猪肉摊位，共计30 份样品；乙腈、甲醇 色谱纯，美国TEDIA 公司；甲酸 色谱纯，美国ACS 恩科化学；乙酸 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙酸铵 色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶>100.000 units/mL 上海安谱实验科技股份有限公司；乙酸铵缓冲溶液0.2 mol/L：称取15.4 g 乙酸铵，超纯水溶解之后，定容至1 L，用适量乙酸调节pH 至5.2；85%乙腈水溶液（含0.2%甲酸）：量取850 mL 乙腈，加入2 mL 甲酸，超纯水定容至1 L；11 种受体激动剂标准品：替扎尼定（99.9%，CAS 号64461-82-1）、赛拉嗪（99.6%，CAS 号23076-35-9）、溴莫尼定（99.0%，CAS 号59803-98-4）、安普乐定（97.0%，CAS 号73218-79-8）、可乐定（98.3%，CAS号4205-91-8） Stanford Chemicals 公司；盐酸赛庚啶（液体，浓度100 μg/mL，CAS 号969-33-5） First Standard 公司；盐酸克伦特罗（99.3%，CAS 号21898-19-1）、沙丁胺醇半硫酸盐（99.4%，CAS 号23031-32-5）、莱克多巴胺盐酸盐（95.0%，CAS 号90274-24-1）、硫酸特布他林（99.6%，CAS 号23031-32-5）

Dr.Ehrenstorfer 公司；西马特罗（液体，浓度100 μg/mL，CAS 号54239-37-1） 农业部环境保护科研监测所；Wates Oasis PRIME HLB 固相萃取小柱 6cc 200 mg，沃特世科技公司；Bond Elut EMRLipid 分散SPE1g/管、EMR-Lipid Bond Elut Polish反萃管2 g/管，安捷伦科技有限公司。

Agilent1290II-6470QQQ 超高效液相色谱串联质谱仪（UPLC-MS/MS） 配有ESI 电喷雾离子源并装有MassHunter B.08.00 数据处理软件，美国Agilent 公司；ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色谱仪、XevoTQ-XS 三重四极杆质谱仪 美国Waters 公司；ME204T 电子天平 精度0.0001 g，上海梅特勒—托利多仪器有限公司；MILLI-Q ADWANTAGE A10 超纯水机 美国密理博公司；SB25-12 DTD 超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；SGLMultis-100 多管涡旋混合仪 岛津（上海）实验器材有限公司；3k15 高速冷冻离心机 美国Sigma 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 准确称取标准品替扎尼定、赛拉嗪、溴莫尼定、安普乐定、可乐定、盐酸克伦特罗、沙丁胺醇半硫酸盐、莱克多巴胺盐酸盐、硫酸特布他林各10 mg 于10 mL 棕色容量瓶当中，用甲醇溶解，定容后，配制成浓度为1 mg/mL 的标准储备液，准确量取液体标准品盐酸赛庚啶、西马特罗1 mL 于10 mL 棕色容量瓶当中，用甲醇溶解，定容后，配制成浓度为10 mg/L 的标准储备液，使用前，用甲醇配制成1 mg/L 的标准物质中间液，根据需要，配制成所需浓度的标准系列工作溶液。

1.2.2 超高效液相色谱条件 色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18RRHD 1.8 μm，2.1 mm×50 mm；流速：0.4 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；流动相；A 为0.1%甲酸水溶液，B 为乙腈，梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Condition of gradient elution

1.2.3 质谱条件 电离模式：电喷雾正离子模式（ESI+）；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）质谱分析方法；毛细管电压3500 V；喷嘴电压500 V；干燥气温度250 ℃；干燥气流量8 L/min；雾化气压力45 psi；鞘气温度300 ℃；鞘气流量11 L/min；11 种受体激动剂的质谱参数见表2。

表2 11 种物质质谱参数Table 2 Chromatography-mass spectrometry parameters of eleven substances

1.2.4 样品前处理 猪肉用粉碎机充分混匀粉碎，称取2.0000 g 左右的样品于50 mL 离心管中，加入2 mL 0.2 mol/L 乙酸铵缓冲溶液（pH=5.2），40 μL 的β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，于37 ℃下水浴振荡16 h，充分酶解，加入8 mL 85%乙腈水溶液（含0.2%甲酸），涡旋5 min，于10000 r/min 冷冻（−4 ℃）离心5 min，取上清液过Waters Oasis PRiME HLB 小柱，弃去前0.6 mL 初滤液，收集流出液0.5 mL，加入初始流动相0.5 mL，涡旋混匀，过0.22 μm 有机滤膜，UPLCMS/MS 进样检测。

1.3 数据处理

UPLC-MS/MS 配有MassHunter B.08.00 数据处理软件，谱图为Origin61 做图软件绘制。

2 结果与分析

2.1 色谱质谱参数的优化

为了获得良好的分离效果，在色谱柱的选择、流动相的选择以及梯度洗脱条件进行了优化。采用C18柱可对11 种物质进行很好的分离，并且峰形良好。流动相的选取对于目标化合物的保留时间和色谱峰形状以及灵敏度也会有很大的影响，根据11 种物质的结构可知，加酸更易使其离子化，因此选择0.1%（v/v）甲酸水与乙腈作为流动相。更改流动相的配比，使11 种物质达到最佳的分离，同时到达最佳峰面积。梯度洗脱程序见表1。

本实验分别配制100 ng/mL 的各种化合物标准溶液，选择ESI+模式，对11 种物质进行优化参数。标准样品与流动性混合后，不经过色谱柱直接连接质谱的方式，利用MRM 采集模式，优化出母离子、子离子、碰撞电压、碰撞能量等参数，优化结果见表2。11 种物质的标准溶液总离子流图和MRM 图提取离子色谱图见图1和图2。

图1 11 种物质标准溶液的总离子流图（1.0 μg/L）Fig.1 TIC chromatograms of standard solution of eleven substances (1.0 μg/L)

图2 11 种物质标准溶液的MRM 图（0.5 μg/L）Fig.2 MRM chromatograms of standard solution of eleven substances (0.5 μg/L)

2.2 前处理条件的选取

2.2.1 提取溶剂的选择β2-受体激动剂大多有苯乙胺醇和叔丁基或异丙基连接而成，一般分为苯胺型（克伦特罗、西马特罗）、苯酚型（沙丁胺醇）、间苯二酚型（菜克多巴胺）。β2-受体激动剂在体内代谢完，会跟羟基结合，进而形成一个葡萄糖醛苷的代谢物，若要检测，需将其酶解后游离出来[29]。而苯胺型的克伦特罗与蛋白结合率低，因而不需要酶解。而α2型与H1型并没有这种现象，综合考虑，仍需对猪肉进行酶解再进行实验，具体酶解步骤为，在猪肉样品里面加入40 μL 的β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，在37 ℃下水浴16 h。选择猪肉样品4 份，分别编号样品1、样品2、样品3、样品4，样品1 与样品2 按照处理步骤进行，样品3 与样品4 不加入β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，其余步骤相同，具体结果见表3。比较4 份样品可以看出，酶解与否，对于α2型与H1型的回收率并无影响。

表3 酶解对α2 型与H1 型回收率的影响Table 3 Effect of enzymatic hydrolysis on recovery of α2 and H1

在不含待测7 种物质的阴性样品中加入标准溶液，进行加标回收试验，提取溶剂分别选用含0.2%（v/v）甲酸的纯乙腈、含0.2%（v/v）甲酸的85%乙腈溶液、含0.2%（v/v）甲酸的70%乙腈溶液，具体结果见图3。结果表明，在纯乙腈中，沙丁胺醇与赛庚啶的回收率仅有60%左右，而在70%的乙腈溶液中，莱克多巴胺、克伦特罗、赛庚啶、西马特罗的回收率均低于60%，原因是纯乙腈没有让基质分散开，提取效率不高，而70%乙腈浓度又偏低，导致标准物质没有很好的提取出来。通过图表可以清楚的判断出，含0.2%（v/v）甲酸的85%乙腈溶液的提取溶剂对11 种物质的提取效果最好，均满足要求。

图3 不同乙腈浓度下各化合物回收率对比Fig.3 Comparison of recoveries using different acetonitrile concentrations

研究甲醇浓度比例对各化合物的影响，分别选用含0.2%（v/v）甲酸的纯甲醇、含0.2%（v/v）甲酸的85%甲醇溶液、含0.2%（v/v）甲酸的70%甲醇溶液，与乙腈的提取溶剂做相应对比，如图4。从图4中可以清晰的看出，甲醇对于赛庚啶基本提取不到，回收率几乎均为零。赛庚啶是易溶于甲醇的，在过PRIME HLB 小柱时，均被吸附在小柱里，没能洗脱出来。因此，不能选择甲醇溶液作为提取溶剂。

图4 不同甲醇浓度比例下各化合物回收率对比Fig.4 Comparison of recoveries using different Methanol concentrations

另外甲酸的添加对提取效果也有影响，见图5。在85%乙腈溶液中分别不添加、添加0.1%（v/v）、添加0.2%（v/v）的甲酸溶液，添加1.0%（v/v）的甲酸溶液，观察每种物质的回收率，不加甲酸的情况下，沙丁胺醇回收率只有40%，其他物质的回收率也均在60%～85%期间，而添加0.1%或0.2%的甲酸，提取效果非常好且基本相同，但是，溴莫尼定这种物质，提取液若是含0.2%，回收率在70%左右，比其他两种提取液的回收率高一些，加酸可以促进其离子化，但是添加甲酸量到1.0%时，回收率没有明显改变，最后选择添加0.2%（v/v）甲酸的85%乙腈溶液作为最终提取溶剂。

图5 不同甲酸浓度下各化合物回收率对比Fig.5 Comparison of analyte recoveries using different concentrations of formic acid

2.2.2 净化方式的选择 本实验采用三种净化方式，方式一不净化，方式二通过Waters Oasis PRiME HLB 通过式固相萃取小柱净化、方式三通过Agilent EMR Lipid 净化管净化。结果见图6，不进行净化，直接上机，虽然有一定的回收率，但杂质较多，对仪器是有一定的损害的，并且基质的去除很有限，因此回收率偏低。其他两种的净化方式回收率相当，但溴莫尼定用EMR Lipid 净化管，回收率比PRiME HLB低一些，因此选择Waters Oasis PRiME HLB 通过式固相萃取小柱进行净化。

图6 不同净化条件下各化合物回收率对比Fig.6 Comparison of recoveries using different clean-up methods

2.3 基质效应与溶剂效应

在农兽药物残留检测方面，存在着两方面的影响，一个是基质效应，由于样品基质复杂，基质对分析过程会产生严重的干扰，另一个是溶剂效应，当样品溶剂与流动相溶剂强度不同时，峰形可能前展或者拖尾，二者均会影响目标物的定量。

2.3.1 基质效应的影响 在运用质谱检测的过程中，样品基质会对实验造成影响，对目标物有抑制或增强作用，统称为基质效应，影响实验结果的准确性和精密度。基质效应消除常用方法有同位素内标法[30−31]、空白基质匹配标准曲线法[32]、前处理方法优化[33]等，同位素内标法是消除基质效应最好的方法，但其缺点是同位素内标价格昂贵，不易购买。本文前处理方法中，使用PRIME HLB 小柱可去除部分基质，净化后的样品是否还存在基质效应的影响，可以利用流动相和空白基质提取液分别配制标准品的方式来验证。

用流动相配制一份标准溶液，浓度为1 ng/mL，再按前处理步骤得到一份空白前处理液，用其配制浓度为1 ng/mL 的标准溶液，比较每种物质在流动相中和基质中的峰面积，得到基质响应相对强度（ME），若ME>100%，表明基质对离子起到增强作用，反之则为抑制作用，从表4中可以看出，除西马特罗是基质增强外，其他均为基质抑制作用，而溴莫尼定、沙丁胺醇和特布他林的ME 值均在60%以下，说明基质对其抑制很严重，因此选择用空白基质配制标准曲线。

表4 11 种物质标准溶液在空白基质提取液和初始流动相中的峰面积Table 4 Peak area of 11 substances in blank matrix extracting solution and initial mobile phase

ME（%）=基质标准峰面积/流动相标准峰面积×100

2.3.2 溶剂效应的影响 溶剂效应会影响物质的峰形与峰宽，因为前处理过程当中，所用提取液为85%乙腈水溶液，而仪器所用初始流动相为5%乙腈水溶液，样品溶液的溶剂强度强于流动相溶剂强度时会造成的峰展宽、峰分叉现象，从而影响定量。为了减少溶剂效应，在进样之前用流动相按1:1 比例稀释，即可解决溶剂效应的问题。

2.4 线性范围、回归方程和检出限

选取11 种物质浓度为1 mg/L 的标准物质中间液配制标准工作液，定容溶剂为空白基质溶液，在0.1～100 μg/L 的范围内选取0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L 几个浓度点，以浓度为横坐标x，待测物峰面积为纵坐标y，绘制标准溶液工作曲线，呈现良好的线性关系，相关系数在0.9992～0.9999。以目标物在空白样品中的3 倍SNR 值计算检出限，检出限为0.5 μg/kg，11 种受体激动剂的线性范围、回归方程和检出限见表5。

表5 11 种物质的线性范围、回归方程、相关系数和检出限Table 5 Linear ranges,regression equation,R2 and limits of detection (LODs) of 11 substances

2.5 方法的回收率和精密度

分别向空白猪肉样品基质中添加各自的检出限，2 倍检出限，10 倍检出限标准品，进行3 个水平的加标回收率试验，按照本方法进行前处理，所得结果的平均回收率在81.3%～117.6%之间，RSD 值在0.7%～6.5%之间，具体数值见表6。

表6 11 种物质的加标回收试验及精密度（n=6）Table 6 Recovery and precision for 11 substances (n=6)

2.6 实际样品检测

猪肉样品30 批次，采用本文所建立的方法进行检测之后，结果显示，有2 批次克伦特罗检出阳性样品，分别为1.51 和2.13 μg/kg。用另一台Waters UPLCMS/MS 检测后，分别为1.46 和2.09 μg/kg，排出了内源性污染源的可能性。这两批次猪肉为市集所购，市集摊位流动性大，猪肉来源不明，养殖户添加了克伦特罗违禁药物，因此本方法可以应用在风险监测样品及突发事件的及时处置当中。

3 结论

本实验采用通过式固相萃取小柱提取猪肉里的目标化合物，超高效液相色谱串联质谱法检测，建立了11 种受体激动剂同步测定的方法。该方法净化步骤简单，高效便捷，覆盖多种受体激动剂，在耗材成本上大大缩减，与SPE 净化方式相比，有着明显的优势。考虑到溶剂效应，用1:1 比例稀释净化液即可消除影响。配合空白基质配制标曲的方式，基本消除了基质效应的影响，检出限与国家标准相当[25−26]，回收率、精密度等均满足要求。通过猪肉中的受体激动剂实际检测结果可知，该方法有一定可靠性，可以很好地用于实际猪肉检测当中。