响应面法优化富含鱼骨钙低温鱼肉香肠配方

王禹赫，巴吐尔·阿不力克木，玛日耶姆古丽·库尔班，李 娜

（新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052）

低温鱼肉香肠是以鱼糜为主要材料，同时添加其他辅料，制作的高蛋白、低脂肪和低固醇的营养型肉制品[1]，因其质地紧实、细腻，味道鲜美，营养全面丰富而受到消费者欢迎[2]。草鱼在我国养殖产量位居第一，约占淡水鱼总量1/5[3]。但草鱼肉容易氧化变质，不可长期保存[4]。因此，鱼糜制品既满足了人们对于高蛋白的营养追求，又可以保证鱼肉在一定时间内不变质。目前，国内现有水产加工企业因缺乏精深加工技术，仅利用了鱼肉部分，忽略了营养同样丰富的鱼骨刺[5],鱼骨刺直接丢弃或鱼粉厂低价收入制成动物饲料、肥料等低附加值产品。不仅造成环境污染和资源大量浪费，同时使企业利润降低。因此，如何利用鱼骨成为高附加值产品，具有一定研究意义。

鱼骨刺中含有丰富的蛋白质、钙和磷等营养成分[6]，且鱼骨中钙磷含量比例合理，易被人体所吸收[7]，应用于食品中，可以增加产品的营养成分，提升产品营养价值。王正云等[8]将鱼骨等下脚料应用到酱油的制作当中，所制酱油香味浓厚，口感鲜美，符合国家二级酱油标准；范鸿兵等[9]运用螯合工艺将鲢鱼鱼骨制备胶原多肽螯合钙；霍健聪等[10]通过碱醇法制备出鳕鱼鱼骨钙片；刘铁玲等[11]将鲢鱼头混合黄豆酱等辅料制作成含钙物质丰富的鲜辣酱。但目前将鱼骨酶解，经微细粉碎制成骨粉添加鱼糜制品的研究还鲜有报道。鱼糜制品是当今社会的新型鱼肉加工制品，具有高蛋白，低脂，食用携带便捷等优点[12]。

本研究以草鱼肉为原材料，研究食盐、鱼骨粉及玉米淀粉对鱼肉低温香肠质构特性、感官指标和蒸煮损失的影响，并通过响应面试验确定三种添加物的最佳添加量，期望研发出富含鱼骨钙的功能型肉制品，为我国肉制品研发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜草鱼 新疆乌鲁木齐市新北园春农贸市场，食盐、孜然粉、姜粉、白砂糖、玉米淀粉 新疆乌鲁木齐市沙依巴克区友好生活超市；胶原蛋白肠衣（直径18 mm） 广东德福隆生物技术有限公司；三聚磷酸钠、焦磷酸钠、六偏磷酸钠 食品级，河南万邦实业有限公司；木瓜蛋白酶（100000 U/g） 食品级，南宁庞博生物工程有限公司。

12 型台式电动绞肉机 上海赛璞有限公司；手动式灌肠器 广东德福隆生物技术有限公司；C21-HT2117HM 电磁炉 广东美的生活电器制造有限公司；LE204E/02 型电子天平 梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司；DZ-400/2 真空包装机 温州奔腾有限公司；TA-XT2i 型质构仪 英国Stable Micro Systems 公司；HH-S4 恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼骨粉的制备工艺 前处理：鱼骨经高温蒸煮方式，使鱼骨上附着鱼肉呈凝胶化后使用清水冲洗掉；去油脂：冲洗后的鱼骨刺在20%异丙醇溶液中，55 ℃条件下浸泡10 h，异丙醇溶液体积淹没鱼骨为宜；酶水解：将去脂后冲洗干净的鱼骨放入烧杯，按料液比1:15 加水，调节pH7.0 条件下加入木瓜蛋白酶，加酶量控制其酶活为2000 U/g，并在55 ℃下酶解鱼骨3 h；高压蒸煮：酶解后的鱼骨在121 ℃、0.1 MPa 条件下蒸煮30 min，对木瓜蛋白酶灭活处理，同时起到进一步去除鱼骨刺表面多余杂质；干燥粉碎：高压蒸煮后流水冲洗干净，烘干水分，使用高速粉碎机将鱼骨粉碎至过200 目筛无残留即得鱼骨粉。

1.2.2 低温鱼肉香肠制作工艺流程 草鱼肉进行绞制，使鱼肉呈现鱼糜状；添加食盐，磷酸盐等腌制剂混合均匀，4 ℃条件下腌制20 h；腌制结束后，添加鱼骨粉，白砂糖等食用添加剂进行二次搅拌，搅拌过程中不断添加冰水，保证鱼糜温度在4 ℃范围内；搅拌好的鱼糜灌入肠衣，排除肠衣内部空气；75 ℃条件下烘烤1 h，80 ℃条件下蒸煮30 min；冷却，晾干水分采用真空包装；4 ℃条件下保存待测。

1.2.3 单因素实验设计

1.2.3.1 食盐添加量的优化 控制在添加复配磷酸盐0.5%、孜然粉0.3%、姜粉0.5%、白砂糖3.0%、冰水20.0%、鱼骨粉1.5%和玉米淀粉6.0%的条件下，分别添加食盐0、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%制作低温鱼肉香肠，通过对香肠的质构（硬度、弹性、咀嚼性、内聚性）、感官评分和蒸煮损失率的分析，确定最佳食盐添加量。

1.2.3.2 鱼骨粉添加量的优化 控制在添加食盐1.5%、复配磷酸盐0.5%、孜然粉0.3%、姜粉0.5%、白砂糖3.0%、冰水20.0%和玉米淀粉6.0%的条件下，分别添加鱼骨粉0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%制作低温鱼肉香肠，通过对香肠的质构（硬度、弹性、咀嚼性、内聚性）、感官评分和蒸煮损失率的分析，确定最佳鱼骨粉添加量。

1.2.3.3 玉米淀粉添加量的优化 控制在添加食盐1.5%、复配磷酸盐0.5%、孜然粉0.3%、姜粉0.5%、白砂糖3.0%、冰水20.0%和鱼骨粉1.5%的条件下，分别添加玉米淀粉0、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%制作低温鱼肉香肠，通过对香肠的质构（硬度、弹性、咀嚼性、内聚性）、感官评分和蒸煮损失率的分析，确定最佳玉米淀粉添加量。

1.2.4 响应面优化试验设计 响应面试验在前期单因素实验结果基础上，设置食盐、鱼骨粉和玉米淀粉添加量为自变量因素，选择感官评分和蒸煮损失率为响应值，采用Box-Behnken 设计出3 因素3 水平响应面试验，探究食盐、鱼骨粉和玉米淀粉对鱼肉低温香肠感官评分及蒸煮损失的影响，确定三种添加物的最佳添加量，响应面试验设计如表1所示。

表1 响应面试验因素与水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.5 指标测定

1.2.5.1 质构测定 参考荣建华等[13]试验方案，略作调整，利用质构仪对低温鱼肉香肠的硬度、弹性、咀嚼性和内聚性进行分析，香肠切成1.5 cm 的圆柱体，采用TPA（Texture Profile Analysis）模式和P/36 R探头，测前、测后速率均为2 mm/s，测中速率1 mm/s，压缩比30%，每组样品平行测定9 次。

1.2.5.2 感官品质评价 将样品切成直径18 mm，高10 mm 的圆柱体，邀请本院食品专业研究生10 名，经相关专业知识与细则学习后，对低温鱼肉香肠进行感官品质评价，每组样品评定前均漱口，减少感官误差，评价标准见表2。

表2 感官品质评价标准Table 2 Sensory quality evaluation standards

1.2.5.3 蒸煮损失率测定 取搅拌好的鱼肉糜制成丸状，置于蒸煮损失袋中，90 ℃恒温水浴锅煮制15 min，取出立即放入干燥器中冷却到室温，冷却至室温后擦去鱼糜凝胶表面水珠进行称量，平行试验3 次，取平均值，根据下式计算样品蒸煮损失率。

式中，W1（g）：样品蒸煮前质量；W2（g）：样品蒸煮冷却后质量。

1.3 数据处理

数据采用Excel2013 进行整理，并采用SPSS22 对单因素实验中的数据进行方差分析和显著性分析，数据表示均为平均值±标准差，利用Origin2018 软件和Design-Expert8.0 进行图表绘制和响应面优化设计。

2 结果与分析

2.1 食盐添加量的优化

食盐是肉制品加工中常见的辅料之一，适宜的食盐添加可以使肉中的可溶性肌球蛋白有效溶出，并附着在肉表面，改善肉中的水分流失现象。由表3可知，食盐的添加对香肠的硬度、弹性和咀嚼性均产生影响，随着食盐添加量的增加，香肠的硬度和咀嚼性呈现显著增长（P<0.05）。这可能因为食盐的添加造成肉糜内外渗透压差异，导致肉糜内部一部份水分流失，同时盐含量的增加会导致蛋白质变性，使香肠持水性降低，产品质地变硬，在检测中产生较高硬度值，并且咀嚼力上升，Brian 等[14]通过研究发现，减少食盐添加量，法兰克福香肠的盐溶性蛋白溶解度出现下降，硬度也出现下降。与对照组（0）相比，添加食盐的样品弹性和内聚性也产生了显著上升（P<0.05），但当食盐添加量由1.5%～3.5%时，香肠的弹性和内聚性增加并不显著（P>0.05），这一研究结果与瞿丞等[15]的研究结果一致，其研究发现在低盐腌制环境下（<6%）鸡肉的弹性不发生显著性变化。

表3 食盐添加量对低温鱼肉香肠质构特性的影响Table 3 Effect of salt addition on the texture characteristics of fish low-temperature sausage

由图1可知，随食盐添加量的增加，低温鱼肉香肠的感官评分呈先上升后下降的趋势，说明食盐的添加可以有效改善香肠的成型率，并且可以掩盖鱼肉自带的腥味；当食盐添加量超过2.5%时，感官评分出现下降，这是由于过量的食盐添加会使产品质地过硬，口感降低，并且食盐过多添加会使产品过咸，风味降低。低温鱼肉香肠的蒸煮损失率也受到食盐添加量的影响，食盐的添加可以显著降低低温鱼肉香肠的蒸煮损失；但食盐添加量超过2.5%后，香肠的蒸煮损失率出现突然上升。这是因为食盐可以增加可溶性蛋白的溶解度，从而提高蛋白的水合作用，使蒸煮损失降低；但在高盐环境下，可溶性蛋白发生变性，产生“盐析效应”，使蛋白的水合能力降低[16]，造成蒸煮损失急剧上升现象。Villamonte 等[17]也通过研究发现，在低盐环境（<4%）下，随食盐浓度的增加，腌制猪肉的蒸煮损失率出现降低的现象。因此，综合以上指标，食盐添加量为2.5%时，产品效果最好。

图1 食盐添加量对低温鱼肉香肠感官评分和蒸煮损失率的影响Fig.1 Effects of salt addition on the sensory scores and cooking loss rate of fish low-temperature sausage

2.2 鱼骨粉添加量的优化

由表4可以看出，与对照组相比，鱼骨粉添加量为1.5%时，低温鱼肉香肠的硬度和咀嚼性显著上升（P<0.05），弹性和内聚性的影响不显著（P>0.05），在鱼骨粉添加量为1.5%时，低温鱼肉香肠的硬度和咀嚼性达到最大值，分别为3331.32、2963.54 g，继续添加鱼骨粉，香肠的硬度和咀嚼性显著下降（P<0.05）。这可能是因为鱼骨粉中含有大量的Ca2+，较低含量的Ca2+对鱼糜中的转谷氨酰胺酶起到一定的激活作用，转谷氨酰胺酶可以提高鱼糜中的可溶性肌球蛋白的交联程度，促进了蛋白质的三维结构暴露内部的一些功能性基团，使相互作用力增大，进而增强香肠的硬度[18]；但Ca2+的含量过高，会在一定程度上抑制转谷氨酰胺酶的活性，影响交联程度，使产品硬度下降。这与叶川等[19]的研究结果大致相同。

表4 鱼骨粉添加量对低温鱼肉香肠质构特性的影响Table 4 Effect of fish bone meal addition on the texture characteristics of fish low-temperature sausage

由图2可以看出，鱼骨粉对低温鱼肉香肠的感官评分和蒸煮损失率产生一定的影响，随鱼骨粉添加量的增加，香肠的感官评分出现先上升后下降的趋势，在鱼骨粉添加量为1.5%时，香肠的感官评分达到最大值（87.5 分），这是由于适当的鱼骨粉添加可以提高低温鱼肉香肠的硬度，从而改善香肠的咀嚼性能，使香肠具有良好的口感，但过量添加鱼骨粉会使鱼肉香肠表面粗糙，品鉴时会有“沙粒感”，同时鱼骨粉过多添加会让香肠鱼腥味过重，导致感官评分降低。香肠的蒸煮损失与其内部结构有关，香肠内部结构越致密、均匀，蒸煮损失率越低，保水性越好，当鱼骨粉添加量0～1.5%时，鱼肉低温香肠的蒸煮损失率持续下降，超过1.5%，蒸煮损失率突然升高，这可能由于适量鱼骨粉添加可以使鱼糜制品的网状结构更加致密，进而锁住香肠中更多水分，但过量的鱼骨粉会使香肠内Ca2+浓度增加，破坏蛋白质交联，导致香肠蒸煮损失急剧升高[20]。综合上述三个指标，在鱼骨粉添加量为1.5%时，鱼肉低温香肠具有较好的品质。

图2 鱼骨粉添加量对低温鱼肉香肠感官评分和蒸煮损失率的影响Fig.2 Effects of fish bone meal addition on the sensory scores and the cooking loss rate of fish low-temperature sausage

2.3 玉米淀粉添加量的优化

由表5可知，随玉米淀粉添加量的增加，低温鱼肉香肠的硬度呈现逐渐上升的趋势，当玉米淀粉添加量为10%时，低温鱼肉香肠的硬度达到最大值，与前五组有显著性差异（P<0.05）。适宜的硬度可以使鱼肉低温香肠富有饱满的外形，同时，产品的硬度决定产品咀嚼性，产品硬度过大会导致咀嚼力增大，影响产品口感。鱼肉低温香肠的弹性随玉米淀粉添加出现小幅度变化，在玉米淀粉添加量6%时，弹性达到最大值，继续添加，低温香肠的弹性出现下降趋势，这可能是因为淀粉颗粒在蒸煮过程中发生糊化，使低温香肠组织结构更加致密，从而弹性得到提高，但当玉米淀粉添加过多，会使香肠的硬度上升，内部水分减少，弹性出现下降。此变化趋势与王晗等[21]研究淀粉对发酵驴肉肠弹性的影响结果一致。

表5 玉米淀粉添加量对低温鱼肉香肠质构特性的影响Table 5 Effects of corn starch addition on texture characteristics of fish low-temperature sausage

由图3可知，随着玉米淀粉添加量的增加，低温鱼肉香肠的感官评分逐渐上升，在玉米淀粉添加量为6%时达到峰值，此时制作的香肠结构紧致，切面平整光滑；继续增大添加量，香肠的感官评分开始出现下降，此时制作的香肠开始出现质地变硬，切面无光泽，口感变差等现象。随玉米淀粉的添加，低温香肠的蒸煮损失出现先降低后上升的现象。在低温香肠蒸煮过程中除鱼糜与水作用形成稳定的凝胶网络，淀粉因高温发生糊化反应，吸收香肠中的自由水，形成稳定的淀粉凝胶网络，使得低温香肠的蒸煮损失率发生下降[22]；继续添加玉米淀粉，淀粉因不断受热糊化、吸水膨胀，导致其破坏鱼糜原有的凝胶网络，造成汁液流失，低温香肠的蒸煮损失率出现上升。根据不同玉米淀粉的三项指标综合衡量，选取玉米淀粉最优添加量为6%。

图3 玉米淀粉添加量对低温鱼肉香肠感官评分和蒸煮损失率的影响Fig.3 Effects of corn starch addition on the sensory scores and the cooking loss rate of fish low-temperature sausage

2.4 响应面优化试验结果分析

2.4.1 响应面模型建立及回归方差分析 为确定低温鱼肉香肠的最佳配方，以单因素实验结果为基础，采用响应面法对低温鱼肉香肠中食盐添加量（A）、鱼骨粉添加量（B）、玉米淀粉添加量（C）进行三因素三水平试验设计，以感官评分、蒸煮损失率为响应值，结果如表6所示。试验结果运用Design-Expert 对各个因素进行二次多元回归拟合，得到低温鱼肉香肠感官评分和蒸煮损失率二次回归方程：

表6 Box-Behnken 响应面试验设计与结果Table 6 Box-Behnken response surface test design and results

低温鱼肉香肠感官评分回归方程：

Y1=88.97−0.68A−0.60B−0.33C−0.13AB+0.49AC−0.30BC−7.69A2−3.08B2−3.99C2

低温鱼肉香肠蒸煮损失率回归方程：

Y2=3.48+0.020A+0.061B+0.061C+0.000AB−0.020AC−0.0025BC+0.65A2+0.21B2+0.27C2

由表7方差分析可以看出，以感官评分为响应值时，模型P<0.0001，表明此预测模型极显著，失拟项不显著（P=0.2172）；R2=0.9943，R2Adj=0.9871，表明此模型可以很好地反映感官评分与食盐、鱼骨粉和玉米淀粉各因素之间的关系。一次项A 和B 对低温鱼肉香肠的感官评分影响显著（P<0.05），二次项A2、B2和C2对低温鱼肉香肠感官评分影响极显著（P<0.01），其余各项均不显著。根据F值可知，各因素对香肠感官评分影响强弱顺序为：A（食盐添加量）>B（鱼骨粉添加量）>C（玉米淀粉添加量）。

表7 感官评分回归模型方差分析Table 7 Analysis of variance of sensory score regression model

由表8可知，以蒸煮损失率为响应值，模型P<0.0001 极显著，失拟项=0.0886>0.05 不显著，拟合度R2=0.9807，R2Adj=0.9558，表明此模型可以很好的描述试验真实情况。一次项中B、C 显著（P<0.05），二次项A2、B2和C2均极显著（P<0.01），通过F值可以判断出，各因素对鱼肉低温香肠蒸煮损失率的影响大小顺序为：C>B>A。

表8 蒸煮损失率回归模型方差分析Table 8 Analysis of variance of the regression model of the cooking loss rate

2.4.2 响应面因素交互作用分析 为更直观地了解各因素交互情况下对各指标的影响情况，根据回归模型方差分析所得数据得出相应的响应面交互图，探究三因素对低温鱼肉香肠感官评分、蒸煮损失率的交互影响，同时，等高线图可以很直观地反映两因素间交互作用对响应值影响的显著程度，等高线稀疏呈圆形表示两因素的交互作用对响应值的影响不具有显著性，等高线紧密且呈椭圆形表示具两因素的交互作用对响应值的影响显著。

由图4～图63D 响应曲面可以看出，在设定的自变量范围内存在响应曲面最高点，说明所选自变量范围符合要求；食盐添加量随着玉米淀粉添加量的变化影响最显著，因从图5可以看出曲线较陡，食盐与鱼骨粉添加量影响次之，玉米淀粉与鱼骨粉添加量变化最为平缓，说明食盐添加量对低温鱼肉香肠的感官品质影响最大，这与感官评分回归方程方差分析结果一致；从等高线图来看，图4、图5均为近圆形，图6椭圆效果相对较明显，因此三因素两两交互对香肠感官影响均不显著，这也与表7的结果相吻合，符合所需产品优化配方。

图4 食盐与鱼骨粉添加量的交互作用对低温鱼肉香肠感官评分的影响Fig.4 Effect of the interaction of salt and fish bone meal on the sensory scores of fish low-temperature sausage

图5 食盐与玉米淀粉添加量的交互作用对低温鱼肉香肠感官评分的影响Fig.5 Effect of the interaction of salt and cornstarch on the sensory scores of fish low-temperature sausage

图6 鱼骨粉与玉米淀粉添加量的交互作用对低温鱼肉香肠感官评分的影响Fig.6 Effect of the interaction of fish bone meal and corn starch addition on the sensory scores of fish low-temperature sausage

2.4.3 产品最优配方与验证试验 采用Design Expert 8.0 进行试验结果分析，由模型预测得出最优配方方案：食盐添加量2.49%、鱼骨粉添加量1.46%、玉米淀粉添加量5.89%，对应的感官评分为89.00 分、蒸煮损失率为3.47%、理论取值R 值0.947，考虑生产便利性调整上述各因素添加量为：食盐添加量2.5%、鱼骨粉添加量1.5%、玉米淀粉添加量6%，平行进行试验3 次，取平均值，得到低温鱼肉香肠感官评分为（88.55±0.57）分，蒸煮损失率为3.51%±0.01%，与预测值相近，制得产品切面光滑、无气泡，鱼肉香气浓郁，无不良风味，由此可以判断，此响应面试验设计的配方方案可行性极高，对实践具有一定指导意义。

由图7～图9中3D 曲面图可以看出，各因素交互作用在设定参数范围内均出现最小点，表明参数范围合理；等高线图中，图7～图9均近椭圆形，说明三因素交互作用对低温鱼肉香肠的蒸煮损失率存在影响，但并不显著（P>0.05），综合回归方程方差分析结果可知，食盐、鱼骨粉和玉米淀粉三因素添加量两两交互作用对低温鱼肉香肠的蒸煮损失率均不显著。

图7 食盐与鱼骨粉添加量的交互作用对低温鱼肉香肠蒸煮损失率的影响Fig.7 Effect of the interaction of salt and fish bone meal addition on the cooking loss rate of low-temperature fish sausage

图8 食盐与玉米淀粉添加量的交互作用对低温鱼肉香肠蒸煮损失率的影响Fig.8 Effect of the interaction of salt and corn starch addition on the cooking loss rate of low-temperature fish sausage

图9 鱼骨粉与玉米淀粉添加量的交互作用对低温鱼肉香肠蒸煮损失率的影响Fig.9 Effect of the interaction of the addition of fish bone meal and corn starch on the cooking loss rate of low-temperature fish sausage

3 结论

在单因素基础上，以食盐添加量、鱼骨粉添加量和玉米淀粉添加量为自变量因素，通过响应面法优化并确定低温鱼肉香肠最优配方。研究表明食盐添加量对低温鱼肉香肠的感官品质影响最大，玉米淀粉添加量对低温鱼肉香肠的蒸煮损失率影响最大。最终，综合所有因素经过三次平行试验验证，确定低温鱼肉香肠中食盐2.5%、鱼骨粉1.5%和玉米淀粉6%，以此条件制作产品的感官评分为88.55 分，蒸煮损失率为3.51%，与模型预测值吻合率分别达到99.49%和98.86%，方案具有一定可行性，为进一步实现低温鱼肉香肠工业化生产提供了一定的数据支撑，为后期试验奠定基础。