不同诊断方法对消化内科幽门螺杆菌感染的诊断价值

袁世梅,杨 伟,魏进武,廖俐雅,余登琼,左崇宇,余晓辉,宋 仁,熊中政

重庆市垫江县人民医院检验科，重庆 408300

幽门螺杆菌最初于消化性溃疡和慢性胃炎患者胃黏膜中发现，是一种微需氧的革兰阴性菌。通过亲密接触、口-口和粪-口等途径传播，幽门螺杆菌已成为全球感染范围最广的细菌之一[1]。近年来大量研究证明，除消化性溃疡和慢性胃炎外，幽门螺杆菌感染还与胃部肿瘤的发生关系密切[2]。此外，神经系统、心血管系统及皮肤、眼科等非消化系统疾病的发生、发展进程中也可见幽门螺杆菌的介导作用[3-4]。因此，积极治疗幽门螺杆菌感染对保护患者身体健康具有重要意义。幽门螺杆菌感染的准确诊断是治疗的先决条件，目前临床幽门螺旋菌感染的诊断常采用14C尿素呼气试验、内镜及血清学检查，但这几种方法检测的准确性尚达不到临床预期。细菌培养虽准确性较高，但检查周期长。故本研究拟对疑似幽门螺旋菌感染患者采用实时荧光定量PCR检测，以探究是否能为临床筛查提供优化方案。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性选择重庆市垫江县人民医院2018年9月至2020年5月收治的临床表现为上消化道症状患者197例，其中男103例，女94例；年龄23～64岁。纳入标准：(1)有不同程度的反酸、嗳气、用餐后腹痛腹胀等消化道症状；(2)接受内镜胃活组织检查；(3)能明白医生指令配合完成检查。排除标准：(1)合并内镜检查禁忌证；(2)肝、胆及胰腺疾病确诊；(3)合并胃癌或其他恶性肿瘤；(4)入组前2周内有抗菌药物、抑酸剂、抗凝剂用药史。本研究符合重庆市垫江县人民医院医学伦理委员会相关规定并获得开展批准，所有受试者及家属对研究流程充分了解并自愿签署知情同意书。

1.2检验及判断方法

1.2.1内镜检查 受试者受检前6 h禁食，2 h禁水，给予受试者去泡剂(四川省自贡鸿鹤制药有限公司)口服，若受试者有需求且无麻醉禁忌证，在其自愿签署麻醉告知书后可给予无痛内镜检查。所有受试者由具有独立操作资质的同级别内镜医生进行检查，采用电子放大内镜结合LUCERA CLV-260内镜系统(OLYMPUS公司)进行检测。参照内镜检查标准，打开联动成像模式将内视镜经食道放至胃窦，再缓慢退镜依次观察胃窦胃体交界处、胃体、胃角和胃底。取受试者胃部发红部位及发黄部位胃黏膜组织，若无明显发红部位则只取一个部位的标本，每例受试者标本分为两份，妥善封存。借助Pipette取色软件测量每例受试者所有取样周围5 cm直径圆圈内R、G、B值，再根据所得的均值计算R/(G+B)，当R/(G+B)≥0.967提示幽门螺杆菌感染阳性[5]。

1.2.214C尿素呼气试验 受试者受检前2 h禁食，取一粒14C尿素胶囊(深圳市中核海得威生物科技有限公司，批准文号：国药准字H20068129，规格：2.78×10-2MBq(0.75×10-3MCi)/粒×40粒)，受试者温水送服，静坐0.5 h后取一加盖样品管收集受试者呼气标本，待样品管中捕集液由紫色变为无色提示标本收集完成。采用幽门螺杆菌测试仪(深圳海得威公司，型号：HUBT-20P)检测呼气样本中每1 mol二氧化碳每分钟衰变指数，当衰变指数≥50，则判断为幽门螺杆菌感染阳性[6]。

1.2.3血清学检测 抽取受试者静脉血4 mL，采用离心机(湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司，型号：L535)分离血清，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测幽门螺杆菌IgG抗体，试剂盒购于美国PBM公司。当IgG抗体滴度≥20 U/mL提示幽门螺杆菌感染阳性[7]。

1.2.4实时荧光定量PCR检测 将受试者胃黏膜组织充分剪碎、研磨，采用RNA提取试剂盒提取标本中的总RNA，加入引物，引物序列：上游5′-TCTGTCGCAAGCTGGCATCGT-3′,下游5′-TCCATAACATGCTCTCATCAT-3′。依次经预变性(94 ℃，3 min)、变性(90 ℃，1 min)、退火(65 ℃，1 min)、延伸(68 ℃，1.5 min)处理，重复退火及延伸操作39次以增加产物量。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算幽门螺杆菌DNA相对表达水平。

1.2.5细菌培养 将受试者胃黏膜组织接种至哥伦比亚血培养基。将培养基置于微需氧环境中恒温(37 ℃)培养，4 d后观察菌落形态。幽门螺杆菌感染阳性表现为：菌落呈细小针尖样，部分融合成片，无色透明，表面湿润且光滑。采用革兰染液对菌落染色，油镜下镜检幽门螺杆菌感染阳性表现为：颜色呈红色，形状呈典型海鹤状或弧形。本研究将细菌培养结果作为检测幽门螺杆菌感染的“金标准”。

1.3统计学处理 采用SPSS23.0软件进行数据处理及统计分析。计数资料采用频数或百分比表示，组间比较采用χ2检验；采用受试者工作特征(ROC)曲线对几种方法的检验效能进行分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1“金标准”检验结果 细菌培养结果显示，幽门螺杆菌感染阳性受试者129例，阴性68例，阳性率为65.48%。

2.2各方法诊断幽门螺杆菌感染的ROC曲线分析 内镜检查、14C尿素呼气试验、血清学检查、实时荧光定量PCR检测幽门螺杆菌感染的ROC曲线下面积依次为0.756、0.838、0.939与0.985，其中PCR的曲线下面积最大。见表1、图1。

表1 不同检验方法对幽门螺杆菌检验效能比较

图1 各方法检测幽门螺杆菌感染效能的ROC曲线分析

2.3各方法检验结果与“金标准”检验结果比较 内镜检查、14C尿素呼气试验、血清学检查、实时荧光定量PCR检测幽门螺杆菌感染的灵敏度依次为72.87%、88.37%、90.69%、94.57%，特异度依次为69.12%、72.06%、85.29%、95.59%，准确率依次为71.57%、82.74%、88.83%、94.92%，其中实时荧光定量PCR检测的准确率明显高于内镜检查、14C尿素呼气试验及血清学检查，差异均有统计学意义(χ2=38.512、14.737、4.898,P<0.05)。见表2。

表2 不同检验方法与细菌培养检测结果对比

3 讨 论

幽门螺杆菌是最常见的病原菌之一，全球约一半的人口为其感染者。流行病学显示，亚洲人群中幽门螺杆菌感染率明显高于欧美人群，这可能与亚洲家族聚居习惯及幽门螺杆菌传染方式有关。我国幽门螺杆菌感染人口呈逐年上升趋势[8]。全球多个研究中心均证实，幽门螺杆菌感染与消化道疾病密切相关，近年来证实，神经、血液、心血管系统疾病的发生与幽门螺杆菌感染有关[4-9]。准确诊断幽门螺杆菌感染，对后期治疗及抑制感染的传播具有积极意义。

目前，临床诊断幽门螺杆菌感染的常用方法有细菌培养、内镜检查、血清学试验及14C尿素呼气试验等，前二者属于侵入性检测，后二者属于非侵入性检测。内镜检测是指将带有镜头的软管经咽喉置入胃中，该方法可直接观测到胃部黏膜状态，并根据黏膜是否异常红肿这一征象，间接判断是否有幽门螺杆菌感染[10]。该方法可较快速得出结论，但对于部分受检者较痛苦，且胃部情况观察及结果判断受操作医生主观影响较大，检查灵敏度及特异度较低。细菌培养是将受试者胃黏膜标本置于微氧恒温的营养培养基中以模拟其在胃内的生存环境，根据培养菌落的外形特点及革兰染色结果对幽门螺杆菌感染情况进行判断。细菌培养灵敏度及准确度均可达到95%以上[11]。且细菌培养可用于药敏检测，对临床合理选择抗菌药物提供依据[12]。但细菌培养时间周期较长，检测过程中可能因标本质量不佳、受其他杂菌污染、运输及储存不当而影响检测结果。本研究采用的血清学检测方法为ELISA法，通过既有特定试剂盒对受试者血清中的幽门螺杆菌抗体进行检测，操作较简便；但血清学抗体检验不能区分既往感染和现症感染，故其在临床中的应用受到一定限制[13]。14C尿素呼气试验凭借其操作简便、结果可靠度较高等特点，成为临床应用最广泛的幽门螺杆菌感染检测方法之一。其操作过程对受试者而言痛苦较小，但检测过程中口服的14C胶囊具有放射性，对幼儿、孕妇及有怀孕计划的育龄期受试者并不适用[14]。

实时荧光定量PCR技术以荧光物质作为标记，在DNA扩增过程中检测每次PCR循环后目的DNA的表达量，并通过特定内参定量分析[15]。目前，实时荧光定量PCR在临床已被广泛应用，在肝炎、获得性免疫缺陷综合征、禽流感等感染性疾病，地中海贫血等遗传疾病，肿瘤诊断及胎儿排畸过程中均有重要意义[16-17]。故而本研究采用实时荧光定量PCR法检测幽门螺杆菌感染情况。本研究结果显示，纳入的197例具有上消化道症状的受试者有129例细菌培养呈阳性，阳性率为65.48%。以细菌培养结果作为“金标准”，将内镜检测、14C尿素呼气试验、血清学检测及实时荧光定量PCR检测结果进行ROC曲线分析，得出实时荧光定量PCR检测的AUC面积最大，为0.985。说明其检测幽门螺杆菌感染的效能较高。且实时荧光定量PCR检测准确率、灵敏度及特异度分别为94.92%、94.57%与95.59%，进一步说明其检测幽门螺杆菌感染的效能较高。且本研究发现，实时荧光定量PCR检测时间较短，相对于细菌培养标本要求限制更少，新鲜标本及石蜡包埋样本均可进行检测。

综上所述，实时荧光定量PCR检测诊断幽门螺杆菌的准确性及灵敏度较高，有望为临床幽门螺杆菌感染筛查提供新思路。但本研究纳入标本较少，后期应进一步扩大标本量以获得更准确的结果。