GPX2、Nrf2蛋白在直肠癌中的表达及与预后的关系*

王科峰,崔 喆,曹景恺,王晓辉

1.上海交通大学医学院附属仁济医院宝山分院/上海市宝山区大场医院普外科，上海 200444; 2.上海交通大学医学院附属仁济医院普外科，上海 200120

直肠癌是消化道常见肿瘤之一，发生于乙状结肠与直肠交界处至齿状线之间，临床多行根治性手术切除以改善患者预后。晚期直肠癌患者由于病情恶化，肿瘤细胞发生转移、侵袭等，预后情况往往较早期患者差。谷胱甘肽过氧化物酶2(GPX2)又称为胃肠特异性谷胱甘肽过氧化酶，是一种含硒蛋白，主要表达于胃肠道系统，具有抗炎抗氧化损伤的作用[1]。近年来研究发现，GPX2在多种肿瘤中高表达，尤其是炎症诱发的肿瘤中，可能起到促进细胞增殖、抑制凋亡等作用[2-3]。关于GPX2在直肠癌中的表达关系近年来国内外少见报道。核因子E2相关因子2(Nrf2)结构中包含亮氨酸拉链，在调节细胞氧化还原中发挥重要作用[4-5]。早期研究发现，肿瘤组织中Hmox1/Nrf2 mRNA水平的比值可能作为大肠癌远处转移的预测因子，提示Nrf2基因可能参与大肠癌的发生、发展[6]。而Nrf2蛋白在直肠癌中的表达情况不甚明确。基于此，本研究通过检测直肠癌患者肿瘤组织中GPX2、Nrf2蛋白表达情况，分析其不同表达水平与患者生存的关系，初步探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年1月至2017年6月于上海交通大学医学院附属仁济医院及上海交通大学医学院附属仁济医院宝山分院肿瘤科行手术切除治疗的直肠癌患者病理组织标本80份，以术中所取癌旁(距肿瘤病灶>5 cm)正常直肠黏膜组织标本57份为对照，所有组织标本均用4%中性甲醛固定，常规脱水，采用石蜡包埋。纳入标准：(1)接受根治术治疗；(2)术前未接受放、化疗或其他抗肿瘤药物治疗；(3)临床资料和随访资料完整。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤患者；(2)合并急慢性感染性疾病者；(3)合并免疫系统疾病患者。所有患者及家属均自愿签署知情同意书，本研究获得本院医学伦理委员会批准。

1.2数据库分析 Ualcan(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)是一个可全面分析癌症组学的网站，其中TCGA数据库可实现相关基因/靶标分析和可视化。基于该数据库，本研究分析GPX2、Nrf2基因在直肠癌组织和正常直肠黏膜组织中的表达。

1.3方法 使用兔抗人多克隆抗体GPX2(美国Sigma公司)，一抗工作浓度为1∶500；兔抗人多克隆抗体Nrf2，稀释浓度为1∶200。将组织以4 μm连续切片，充分烘烤后采用免疫组化法检测直肠癌组织和正常直肠黏膜组织GPX2、Nrf2蛋白的表达情况。标本检测均由检验科两名经验丰富的医生进行操作，免疫组化Envision染色法按照试剂盒说明书步骤进行。利用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。

用半定量方法对免疫组化结果进行判定。随机选取5个高倍镜视野进行染色结果评分，取平均值。评分方法如下，(1)依据细胞染色强度进行评分：细胞不着色记为0分，淡黄色记1分，黄色或黄棕色记2分，棕褐色或深褐色记3分；(2)依据阳性细胞所占百分比进行评分：阳性细胞<5%记为0分，阳性细胞占5%～25%记1分，>25%～50%记2分，阳性细胞>50%记3分。将细胞染色强度和阳性细胞所占百分比评分的乘积作为最终得分，若最终得分≥2分，判定为表达阳性(+)，<2分为表达阴性(-)；同时将得分≥3分定义为高表达，<3分定义为低表达。

1.4随访观察 所有患者均进行电话随访或门诊随访，第1～2年每3个月进行一次随访，第3年每6个月进行一次随访。随访时间从术后开始，截止日期为2020年6月，随访时间为10～42个月，中位随访时间为27个月。分析不同GPX2、Nrf2蛋白表达水平直肠癌患者的生存情况。

1.5统计学处理 采用SPSS25.0软件进行数据的录入与分析。计数资料以频数或百分比表示，组间比较采用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier法，组间生存曲线差异用对数秩检验(Log-Rank test)；多因素Cox回归分析影响直肠癌患者预后不良的危险因素分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1GPX2、Nrf2基因在直肠癌组织和正常直肠黏膜组织中的表达差异 比较TCGA数据库中166份直肠癌组织标本和10份正常直肠黏膜组织标本中GPX2、Nrf2基因的表达水平，结果显示，GPX2基因在直肠癌组织和正常直肠黏膜组织中表达差异有统计学意义(P<0.05)，Nrf2基因表达差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2GPX2、Nrf2蛋白在直肠癌组织和正常直肠黏膜组织中的免疫组化结果 免疫组化结果显示，GPX2、Nrf2蛋白主要定位于直肠癌组织细胞的细胞质和细胞膜，见图1。GPX2、Nrf2蛋白在直肠癌组织中的阳性表达率分别为67.50%(54/80)、76.25%(61/80)，明显高于正常直肠黏膜组织中的24.56%(14/57)、31.58%(18/57)，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 GPX2、Nrf2蛋白在直肠癌组织和正常直肠黏膜组织中的阳性表达情况[n(%)]

2.3直肠癌组织中GPX2、Nrf2蛋白表达相关性 GPX2、Nrf2蛋白在直肠癌组织中共表达阳性46例，共表达阴性11例，二者表达存在相关性(χ2=7.325，P<0.05)。见表2。

表2 直肠癌组织中GPX2、Nrf2表达相关性(n)

2.4直肠癌组织中GPX2、Nrf2蛋白表达情况与患者特征之间的关系 GPX2、Nrf2蛋白表达情况在不同年龄、性别、肿瘤大小直肠癌患者之间，差异无统计学意义(P>0.05)，在不同肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移直肠癌患者之间，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 直肠癌组织中GPX2、Nrf2蛋白表达情况与患者特征之间的关系(n)

续表3 直肠癌组织中GPX2、Nrf2蛋白表达情况与患者特征之间的关系(n)

注：A表示GPX2在直肠癌组织中高表达；B表示GPX2在正常直肠黏膜组织中低表达；C表示Nrf2在直肠癌组织中高表达；D表示Nrf2在正常直肠黏膜组织中低表达。

2.5GPX2、Nrf2蛋白表达情况与直肠癌患者术后3年生存情况的关系 直肠癌组织中GPX2蛋白高表达组和低表达者3年累积生存率分别为31.92%、45.54%，经Log-Rank比较，差异有统计学意义(χ2=4.429，P=0.035)；Nrf2蛋白高表达者和低表达者3年累积生存率分别为26.93%、51.27%，经Log-Rank比较，差异有统计学意义(χ2=7.822，P=0.009)，见图2、3。

图2 GPX2蛋白表达与直肠癌患者3年累积生存率的关系

2.6影响直肠癌患者预后的多因素Cox回归分析 多因素Cox回归分析结果显示，GPX2蛋白高表达、Nrf2蛋白高表达、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移是影响直肠癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)，见表4。

图3 Nrf2蛋白表达与直肠癌患者3年累积生存率的关系

表4 影响直肠癌患者预后的多因素Cox回归分析

3 讨 论

GPX2是一种含硒酶，属于谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)家族，是谷胱甘肽氧化还原系统的关键酶。目前已知GPX家族有8个亚型(GPX1～GPX8)，其中在人类中表达的有5种，分别为GPX1、GPX2、GPX3、GPX4、GPX6，且均是含硒蛋白[7-8]。研究表明，硒具有抗氧化、抗衰老、提高机体免疫力和预防地方性疾病等作用，硒主要以硒蛋白的方式发挥生物学功能，因此，GPX2在抗氧化损伤、抗炎等方面的研究已较为普遍[9-10]。随着研究的深入，人们发现GPX2在肿瘤中也发挥重要作用。有研究发现，利用硒增强饲粮喂养慢性结肠炎小鼠可增加结肠组织中GPX2表达，从而降低氧化应激作用，使小鼠免于罹患慢性炎症引起的结肠癌[11]。EMMINK等[12]研究发现，GPX2沉默可导致结直肠癌细胞中自由基氧的积累，增加细胞凋亡，降低克隆形成和转移能力，而GPX2过表达则有利于细胞对自由基氧的清除，有利于细胞增殖和肿瘤生长，促进克隆形成和转移能力。本研究免疫组化结果显示，GPX2蛋白在直肠癌组织中的阳性表达率明显高于正常直肠黏膜组织，与TCGA数据库中GPX2基因表达趋势一致；进一步分析直肠癌患者特征发现，GPX2蛋白表达水平在不同肿瘤分化程度、不同TNM分期、是否有淋巴结转移的直肠癌患者之间，差异有统计学意义(P<0.05)，提示GPX2蛋白高表达与肿瘤恶性进展有关，推测GPX2蛋白高表达可能有利于肿瘤细胞应对氧化应激，使得直肠癌细胞增殖、迁移侵袭能力增强，从而促进疾病发展。生存分析结果显示，GPX2蛋白高表达患者3年累积生存率与GPX2蛋白低表达患者相比明显降低，提示GPX2蛋白高表达与直肠癌患者预后不良有关。另外，有学者发现GPX2通过Wnt通路介导肿瘤细胞增殖、侵袭和转移[13]，然而该通路是否在直肠癌中发挥调控作用有待进一步细胞实验研究。

Nrf2属于碱性亮氨酸拉链(bZIP)家族，作为转录因子可调控抗氧化应激反应元件(ARE)、GPX2等抗氧化蛋白的表达[14]。研究发现，Nrf2结构中包含7个高度保守的多肽域，其中Neh2是与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)结合的结构域[15]。研究发现，癌细胞中Nrf2的异常激活是通过Keap1或Nrf2基因的体细胞突变及其他破坏Keap1与Nrf2结合的机制发生的[16]。Nrf2是细胞抗氧化反应的主要调节因子，已有研究证实正常细胞中Nrf2缺失所致氧化应激过分激活可导致DNA损伤突变，增加肿瘤发生及恶化风险[17]，然而Nrf2蛋白在肿瘤中表达上调，亦可提高癌细胞的抗氧化和解毒能力，赋予肿瘤细胞快速增殖生长、转移、侵袭等致癌活性，对荷瘤宿主产生不利影响[18-19]。国内学者靳倩倩等[20]研究发现，Nrf2蛋白在结直肠癌组织中阳性表达率明显高于癌旁组织，且Ⅲ～Ⅳ期患者Nrf2蛋白阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期，说明Nrf2蛋白参与结直肠癌的发生、发展。本研究免疫组化结果显示，Nrf2蛋白在直肠癌组织中的阳性表达率明显高于正常直肠黏膜组织，与TCGA数据库中趋势不一致，可能是因为基因与蛋白水平存在一定差异。另外，Nrf2蛋白表达水平与直肠癌患者肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移有关，提示Nrf2蛋白可能通过调控肿瘤细胞氧化应激及炎症作用影响癌症发展。本研究还发现，直肠癌组织中GPX2与Nrf2蛋白表达具有一定的相关性，提示GPX2、Nrf2蛋白在直肠癌可能共同作用参与调控直肠癌的发生、发展，Nrf2蛋白可调控GPX2蛋白表达，二者在直肠癌中的具体作用机制有待进一步研究。生存分析结果显示，Nrf2高表达患者3年累积生存率明显低于低表达患者，表明Nrf2蛋白与直肠癌患者预后不良有关。进一步Cox回归分析结果显示，GPX2蛋白高表达、Nrf2蛋白高表达、TNM分期Ⅲ～Ⅳ、淋巴结转移是影响直肠癌患者预后的独立危险因素，提示GPX2蛋白高表达、Nrf2蛋白高表达患者预后不良风险增高，GPX2、Nrf2蛋白可能成为临床治疗直肠癌的潜在靶点。

综上所述，直肠癌组织中GPX2、Nrf2蛋白呈高表达，GPX2、Nrf2蛋白高表达患者3年累积生存率较低表达患者短，进一步研究发现，GPX2与Nrf2蛋白水平有一定相关性，推测Nrf2可能调控GPX2表达，共同通过氧化应激途径影响直肠癌的发展，进而影响患者预后，然而具体作用机制有待更深入研究。