鸡精液冷冻保存技术研究进展

聂瑞雪，李俊英，苗欢欢，凌 遥，张 浩，吴常信

（中国农业大学动物科学技术学院畜禽育种国家工程实验室，北京 100193）

精液冷冻（Semer Cryopreservation）是指新鲜精液经过程序化处理后在液氮或其他冷源的辅助下迅速凝结的技术，精液冷冻使精子的生命活动被抑制从而达到长期保存的目的。精液冷冻保存技术在家畜生产中迅速发展，目前奶牛精液冷冻保存应用最为广泛[1]，而猪[2]、绵羊[3]、马[4]、鸡[5]的精液冷冻保存技术尚未广泛应用，但近年来也取得了一定进展。

鸡精液冷冻研究最早始于1941 年，Shaffner 等[6]将鸡精液于-6℃保存30 s 后进行人工授精，成功孵化出1 只雏鸡，这是世界上有文献记载的第一只由冷冻处理后的精液受精孵化而来的雏鸡。1949—1951 年，Polge[7-8]团队意外发现甘油在冷冻条件下（-79℃）对精子有保护作用，便开始将甘油添加到鸡精液稀释液中，最终成功孵化出35 只雏鸡。随后国内外对鸡精液稀释液、冷冻保护剂、冷冻程序、解冻过程等技术环节展开了诸多研究。

精液冷冻技术对于家禽生产业发展和优良种质资源保护至关重要。随着高通量测序和芯片技术的发展，全基因组选择（Genome Selection，GS）作为新一代选育技术已经逐渐应用到奶牛[9-10]、猪[11]、山羊[12]等家畜的遗传改良，在鸡上的应用也开始受到关注[13-14]。稳定、高效的鸡精液冷冻保存可以大幅降低GS 中饲养公鸡的成本，加快育种进展[15]。利用鸡精液冷冻技术还可以建立遗传资源基因库，保护濒临灭绝的珍稀禽类以及地方特色禽类品种。

目前，鸡精液冷冻保存解冻后的精子活力、受精率、保存时间等指标均不理想。鸡精液冷冻技术仍处于研究阶段，未能在生产中应用[5]，还需结合其精液特点和精子结构，优化冷冻体系，建立一套兼具高受精率和高稳定性的冷冻保存程序，为基因组选择在家禽中的顺利应用和珍稀禽类遗传资源的保护提供保障。本文概述国内外关于鸡精液冷冻的最新研究进展，分析鸡精液冷冻程序中存在的诸多问题，为今后的研究提供参考。

1 鸡精子结构和特点

与哺乳动物的精子相比，鸡的精子对于低温冷冻更加敏感。同样采用人工授精，冷冻鸡精液的受精能力显著低于鲜精液，新鲜精液的受精率可达90%，而冷冻后精液的受精率仅在55%左右[5,16]。冻融降低鸡精子受精能力的原因尚不完全清楚，可能与其独特的细胞形态和生理特征有关。

1.1 鸡精子的形态结构易受冷冻损伤 不同物种的精子形态存在一定差异，但结构上具有共性，均由头部、颈段和尾部组成。鸡精子头部整体呈长圆柱形，顶端为锥形（图1）[17-19]。鸡精子细丝状的尾部由颈段与头部相连，头部的宽度与尾部没有明显差别，与公牛的精子头部相比，鸡精子头部的容积更小（图2）。在进行冷冻操作中，鸡精子头部能够容纳的冷冻保护剂十分有限，因此冷冻保护剂对鸡精子的保护效果低于哺乳动物。Villaverde-Morcillo[17]测量了鸡精子头部的尺寸，长度为（13.5±3.5）μm，宽度为（1.3±1.7）μm，鸡精子除了头部以外的长度可达90 μm[21]。与其他物种相比，鸡精子的尾部更长，在冷冻、解冻的过程中更容易受到损伤，尾部断裂的精子无法进行游动，这也是经冷冻后解冻的精子受精率低的原因之一[22]。

图1 显微镜下的鸡精子[17]（Hemacolor 法染色）

图2 不同物种的精子示意图[20]

1.2 鸡精子的质膜结构易受冷冻损伤 前人[22]研究结果表明，冻融操作也会导致精子膜结构的损伤，主要表现在精子颈段产生畸形。新鲜鸡精液的颈段畸形率只有0.9%，受精率为85.9%，而经过低温冷冻的精子颈段畸形率达到49.1%，受精率仅有46.8%[23]。Olexikova[24]利用透射电镜评估新鲜鸡精子和冷冻后解冻鸡精子的浆膜和顶体外观，根据质膜的状态将精子分为3 个等级（图3）。一级的精子质膜完整且顶体后部稍有肿胀，二级是顶体和顶体后部均出现肿胀，三级的精子质膜已经完全遭到破坏，顶体与精子颈发生分离。研究表明，鲜精中有87% 的精子属于一级，而冷冻后解冻的精子只有约25% 的精子属于一级、二级和三级的精子占绝大部分[24]。因此，冷冻保存会导致鸡精子发生不同程度的浆膜和顶体损伤，顶体的缺失可能是冻存鸡精子受精能力下降的又一主要原因。

图3 透射电镜下的鸡精子，（a）（b）（c）分别代表一级、二级和三级精子[24]

1.3 鸡精子质膜结构易受氧化损伤 精液冷冻过程中的冻融操作会改变精子环境的渗透压，而精子质膜的成分和质膜的流动性是适应渗透变化必不可少的因素[25-26]。精子质膜由脂质、胆固醇和蛋白质组成，质膜中还有很高比例的不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acid，PUFA）。活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）是组织进行正常有氧代谢的天然产物，可以维持细胞内的正常功能。当精子受到冷冻保存等外源刺激时，其产生大量的ROS 会诱导质膜上的PUFA 发生过氧化反应（Lipid Peroxidation，LPO），从而损伤精子质膜[27]。由于鸡精子质膜的成分特点，与哺乳动物相比鸡精子更易发生LPO，导致精子内线粒体膜和细胞膜的损坏，胞内酶渗漏，DΝA 片段损伤，精卵融合困难，最终表现为解冻后精子活力降低，受精率低[28]。为降低ROS对鸡精子的冷应激，研究人员在精液稀释中添加超氧化物歧化酶[29]、过氧化氢酶[30]、维生素E[31]、褪黑激素[32]、白藜芦醇[33]等抗氧化剂来保护精子，且取得了一定的效果。

精子质膜流动性与质膜成分有关，其有助于精子解冻后膜生理状态的修复，是预测精子耐冷冻能力的可靠指标[34]。研究质膜流动性的常规技术是荧光探针法，将荧光探剂（如1,6 -diphenyl-1,3,5-hexatriene）与细胞质膜结合，以形成发光的络合物再进行检测，荧光强度越大，细胞质膜的流动性就越小[34]。Blesbois 等[35]研究表明，测得荧光值越低，鸡精子质膜的流动性越高，冻后精子畸形或死亡的数目越少，说明精子质膜流动性与精子抗冻相关，是精子在冻融后恢复活力并维持受精能力的可靠预测因子。

2 鸡精液冷冻保存优化技术方案研究

针对鸡精子特点，结合精液冷冻环节的原理，研究人员在优化鸡精液冷冻技术方面积极开展研究，包括冷冻保护剂种类[36]、冷冻保护剂浓度优化[37]、冷冻速率优化[38]、添加抗氧化剂[38]，以及不同的冷冻剂型[39]。笔者整理了近年来关于鸡精液研究的结果，详见表1。

表1 近年来关于鸡精液冷冻研究的报道

2.1 鸡精液冷冻保护剂的研究 鸡精液冷冻最常用的冷冻保护剂是甘油和二甲基乙酰胺（DMA）[40]。甘油常用来制作0.25 mL 的细管冻精，具有易标记和管理方便的优点，但是甘油具有生殖毒性，在授精之前要通过离心法来降低甘油对精卵结合的影响[41]。DMA 用来制作冻精颗粒的效果比较好，省去了在人工授精之前离心去掉保护剂的步骤，但由于颗粒冻精不便于标记，不适用于需要区别鸡个体的情况。Wu[37]在研究中同时考虑甘油浓度（2%、4%、6%、8%、11%）和冷冻速率对鸡精液受精能力的影响，结果显示，冻精细管距离液氮表面6 cm 时解冻后精子活率最高，各甘油浓度梯度的精子活率分别是57%、70%、70%、82%、82%，说明甘油浓度越高，对精子的保护效果越好，冻融之后的活率越好；但后续用清洗-离心法去甘油后进行深阴部人工授精，各甘油浓度保护精液的种蛋受精率分别为34.8%、75.1%、77.6%、70.0%、57.4%，入孵蛋孵化率分别为26.2%、71.4%、73.3%、69.4%、55.6%。这可能是因为高浓度甘油保护时，脱甘油会对精子造成伤害，少量残余的甘油会阻碍精子向受精部位游动，从而影响受精率。Wu[37]研究结果中的77.6%受精率是目前冷冻鸡精液达到的较高水平，但该研究中精液冷冻保存时间较短，人工授精频率高，且采用深阴部授精，很难在鸡生产中推广应用。

2.2 抗氧化剂的研究 在精液稀释液中添加抗氧化剂可以防止鸡精子遭受氧化损伤。常用于鸡精液的抗氧化剂有过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶，以及维生素E、维生素C、褪黑激素、番茄红素、硒、锌等[42]。褪黑激素因其对自由基有清除作用被广泛认为是一种有效的抗氧化剂，可以保护细胞的完整，维持细胞功能[43]。Mehaisen[32]将一定浓度的褪黑激素添加到稀释液中，解冻后的鸡精子活率为34.7%，空白对照组为25.3%。Appiah[44]将褪黑激素作为抗氧化剂，结果显示解冻后的鸡精子活率为39.67%，空白对照组为32.33%。目前的研究结果还不足以说明褪黑激素对解冻后精子的受精能力有保护作用，但通过研究可以发现，褪黑激素可以促进自由基在细胞膜上的转运和在线粒体内的积累，从而达到保证膜完整性和线粒体具有活力的目的[44]。线粒体活力正常可以保持能量的正常供应，为精子提供解冻后的能量来源。因此褪黑激素对精子细胞膜的有益作用可以积极地反映在精子功能和活力[45]。

2.3 精液稀释液的研究 鸡精液密度高、黏性大，理想的精液稀释液可以为精子的代谢活动提供能量，维持pH 和渗透压的稳定，保障精子生命活动的正常进行。Thananurak[46]用泰国本地鸡作为研究对象，比较了3种鸡精液冷冻稀释液对解冻后精子活率和受精率的影响结果显示，采用布卢姆贝格尔稀释液（BHSV-based Extender）的精子解冻后活率为68.83%，使用Sasaki稀释液（Sasaki Extender）的解冻后活率为68.50%，TΝC 稀释液（Thai Νative Chicken Extender，TΝC）的解冻后活率是66.33%，将解冻后精液进行人工授精，受精率分别为73.37%、77.27%、90.27%，但该研究中用于人工授精的母鸡数较少（12 只），冷冻保存时间不明确，对于新的稀释液效果和稳定性还有待进一步研究。

精液稀释液还可以承载抗氧化剂和冷冻保护剂，贝兹维尔稀释液[47]（Beltsville Extender）和雷克稀释液[48]（Lake Extender）应用较为广泛，分别添加抗氧化剂虾青素[47]和谷胱甘肽[48]可以提高精子的抗氧化能力，解冻后的活率分别为68.6%、58.8%。纳比稀释液（Νabi Extender）是一种新型稀释液，Νabi[49]对比发现，用纳比稀释液处理的精液解冻后活率为65.4%，效果优于传统的贝兹维尔稀释液。理想的精液稀释液会保护精子免受冷冻损伤和氧化应激，保持精子质膜的完整性，使精子保持良好的解冻后受精水平。

3 展 望

鸡精液冷冻保存对于家禽业的生产和遗传多样性的保存具有至关重要的意义，但是鸡精液冷冻技术目前不能用于生产实践。在过去的几十年里，鸡精液冷冻技术取得了一定的进展，但没有建立一套规范的技术标准。鸡精液进行冷冻目的是对精子进行长期保存，但目前的研究鲜有对冷冻时间进行记录，对保存时长的研究还不够重视。未来的研究中应该侧重无毒无害冷冻保护剂的挖掘，细化冷冻保护剂和抗氧化剂对精子不同部位的保护作用，精子抗冻性的机制研究，以期得到保护作用全面、没有生殖毒性、经济实用的综合鸡精液稀释液，从而进一度提高鸡精液冷冻水平，早日用于生产实践。