霉菌毒素的不同检测方法 在饲料生产中的应用探讨

张鹏 巩新民 李玉燕 王怀娜 包丹丹 祝永华 郭龙宗

摘  要：霉菌毒素目前常用的检测方法有薄层层析法（TLC）、色谱法、质谱联用技术、免疫化学检测法等。各种检测方法的灵敏度、准确度、稳定性、检测环境、操作难易程度、设备和费用的局限应用领域有较大的差异。本实验室采用高效液相色谱（HPLC-MS/MS）、横向流动免疫技术（LFD）、酶联免疫吸附法（ELISA）三种方法测定玉米基质定值质控品A、B、C样品的呕吐毒素、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮三种毒素的含量，评估空白样品和定值质控品的检测结果和回收率，根据临床应用，比较三种不同的霉菌毒素检测方法的优缺点。准确度评估结果显示：HPLC-MS/MS法>ELISA法>LFD法，但三种方法都有各自的优缺点，实际生产可以灵活选择使用。

关键词：霉菌毒素; 色谱法;横向流动免疫技术;酶联免疫吸附法

中图分类号：S856.9        文献标识码：B        文章编号：1673-1085（2021）5-0005-05

霉菌毒素是指霉菌在寄生物质上进行生命活动所产生的有毒代谢产物，常见的寄生物质包括食品或农作物等。这些有毒物质被人和动物摄入体内后，会引起肝脏、肾脏、生殖系统、神经系统、被皮系统等各器官机能障碍，甚至危及生命。霉菌毒素广泛存在于自然界中，种类繁多，常见的有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素等。因霉菌毒素污染给食品加业、畜禽养殖业、饲料加工业造成了巨大的经济损失，因此霉菌毒素污染问题已经被现代农业生产者以及食品加工业高度重视，各种霉菌毒素的检测技术及检测试剂应运而生。目前常用的霉菌毒素检测方法有薄层层析法（TLC）、色谱法（薄层色谱TLC、气相色谱GC、高效液相色谱HPLC）、质谱联用技术（气质联用CG-MS、液质联用HPLC-MS/MS）、免疫化学检测法（横向流动免疫技术LFD、胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附法ELISA）等。本实验室采用临床常用的三种检测方法测定玉米基质A、B、C样品的呕吐毒素、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮三种毒素的含量，比较三种不同的霉菌毒素检测方法的结果差异，总结与探讨霉菌毒素检测方法在各领域应用的优势和劣勢。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  玉米基质样品  待检样品为玉米基质A、B、C 3份，其中A为空白样品（<10ppb），B、C为定

值的质控样品。B样品呕吐毒素的真实值为（0.705±0.055） ppb，玉米赤霉烯酮的真实值为（125±15） ppb，黄曲霉毒素B1的真实值为（13.5±1.5） ppb;C样品呕吐毒素的真实值为（1.41±0.11） ppb，玉米赤霉烯酮的真实值为（250±30） ppb，黄曲霉毒素B1的真实值为（27±3） ppb。

1.1.2  主要试剂  选取2个品牌的3个品项的ELISA

检测试剂盒（呕吐毒素ELISA检测试剂盒、玉米赤霉烯酮ELISA检测试剂盒、黄曲霉毒素B1 ELISA检测试剂盒），2个品牌的3个品项的LFD快速定量检测条（呕吐毒素LFD快速定量检测条、玉米赤霉烯酮LFD快速定量检测条、黄曲霉毒素B1 LFD快速定量检测条），多功能净化柱、色谱级甲醇、色谱级乙腈、正己烷、乙酸、三氟乙酸、霉菌毒素标准液等。

1.1.3  主要仪器  MK3酶标仪（美ThermoFisher公司），LFD快速定量检测条配套检测仪，液相质谱质谱联用仪（型号1290/6460，美国Agilent公司），电子天平，粉碎机，离心机，水浴锅等。

1.2  方法  检测方法为色谱法（HPLC-MS/MS）、

酶联免疫吸附法（ELISA）、横向流动免疫技术（LFD）。霉菌毒素检测样品的预处理及实验分析严格按照试剂盒和仪器的操作说明书进行，完成A、B、C三份待检样品的含量测定并计算检测结果和回收率。实验依据GB/T27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测附录F（资料性附录）检测方法确认的技术要求，回收率参考范围见表1。

2  结果

2.1  B样品和C样品呕吐毒素（DON）检测数据

结果  本次实验对B样品和C样品中的呕吐毒素

（DON）采用3种方法进行88次检测，其中采用LFD方法进行22次检测，合格率为36.4%（8/22）;采用ELISA方法进行62次检测，合格率为69.4%（43/62）;HPLC-MS/MS方法进行4次检测，合格率为100%（4/4）。

检测结果见图1。

2.2  B样品和C样品玉米赤霉烯酮（ZEN）检测数

据结果  B样品和C样品玉米赤霉烯酮（ZEN）采用3种方法进行73次检测，其中采用LFD方法进行15次检测，合格率为53.3%（8/15）;采用ELISA方法进行51次检测，合格率为64.7%（33/51）;HPLC-MS/MS方法进行7次检测，合格率为71.4%（5/7）。检测结果见图2。

2.2  B样品和C样品玉米赤霉烯酮（ZEN）检测数

据结果  B样品和C样品玉米赤霉烯酮（ZEN）采用3种方法进行73次检测，其中采用LFD方法进行15次检测，合格率为53.3%（8/15）;采用ELISA方法进行51次检测，合格率为64.7%（33/51）;HPLC-MS/MS方法进行7次检测，合格率为71.4%（5/7）。检测结果见图2。

2.3  B样品和C样品黄曲霉毒素B1检测数据结果

B样品和C样品黄曲霉毒素B1采用3种方法进行73次检测，其中采用LFD方法进行16次检测，合格率为56.3%（9/16）;采用ELISA方法进行51次检测，合格率为72.5%（37/51）;HPLC-MS/MS方法进行6次检测，合格率为83.3%（5/6）。检测结果见图3。

3  讨论

从B、C两份玉米基质样品的检测结果我们可以得出，HPLC-MS/MS法准确度高，稳定性和重复性高，能够检出饲料及食品中少量的霉菌毒素，很少出现假阳性，是比较理想的一种霉菌毒素检测方法;但由于此方法所用仪器耗材昂贵，对操作人员的技术要求较高，检测方法及样品前处理相对繁琐，操作难度较大，检测结果相对滞后，并未在畜禽养殖及饲料加工企业中广泛应用，多应用于一些专业的检测机构以及科研领域。

ELISA方法的准确度略低于色谱法，其优点是操作简便、灵敏度高、干扰小、安全性高、污染少、成本低、快速定量检测，而且对样品纯度要求不高，无需贵重仪器;其缺点是ELISA试剂盒容易受温度、试剂盒品牌、酶标仪的灵敏度影响，导致稳定性和可重复性略差，本方法适用于饲料厂、粮食粗加工、养殖场对饲料原料的筛选及成品饲料的霉菌毒素含量检测。

LFD的方法简便快速，无需复杂的设备、携带方便，适用于饲料生产及粮食粗加工现场，对操作人员的专业知识要求不高，准确度略低于色谱法和ELISA法。此方法适用于饲料厂、粮食粗加工厂对原料及粮食的初筛，必要的时候采用色谱法或ELISA法对检测结果进行确认。

在人类对食品安全意识和动物福利意识不断提高的当下，霉菌毒素的检测在粮食加工企业、饲料厂及养殖企业也得到高度重视。因此，实验室无论采用哪种检测方法，在首次采用方法前都要对分析方法的适用性、准确度、检出限和定量限、线性及校准、回收率、稳定性、测量的不确定性进行评估和验证，根據实际需要选择一套简便、快速、准确的检测方法，保证检测结果有科学依据以及准确、可靠、可行。

Application of different detection methods of mycotoxin in feed production*

ZHANG Peng ，GONG Xinmin， LI Yuyan， WANG huaina，BAO Dandan，ZHU Yonghua** ，GUO Longzong**

（Shandong Yisheng Animal and Poultry Breeding Company，Shandong Yantai 264680，China）

Abstract： Thin layer chromatography （TLC）， chromatography， mass spectrometry and immunochemistry are commonly used to detect mycotoxins now. There are great differences in sensitivity， accuracy， stability， detection environment， operation difficulty， equipment and cost of various detection methods. The contents of vomit toxin， aflatoxin B1 and zearalenone in samples A， B and C were determined by high performance liquid chromatography （HPLC-MS / MS）， LFD and ELISA. The detection results and recovery rates of blank samples and quality control samples were evaluated. The advantages and disadvantages of three different mycotoxin detection methods were compared. The accuracy evaluation results showed that： HPLC-MS / MS > ELISA > LFD method， but the three methods have their own advantages and disadvantages， and can be flexibly used in actual production.

Keywords：Mycotoxin;Chromatography; Cross flow immunoassay; Enzyme linked immunosorbent assay.