衍生化技术在色谱法检测有机农药残留中的应用

熊琳等

摘要：近年来，农药残留检测技术取得了较快的发展，其中色谱法由于具有高效、高灵敏度、便捷的优点，成为农药残留检测最主要的手段。但由于受到检测仪器的限制，常规的色谱法对一些农药残留无法测定，通过残留物与衍生化试剂的化学反应，使这些残留物能够被检测仪器检测，这就显著地扩大了色谱法的使用范围。对衍生化技术在色谱法检测有机农药残留中的应用作了较为全面的阐述，旨在为农产品风险评估提供更好地服务。

关键词：农药残留；衍生化；色谱法

中图分类号：O657.7；S481+.8 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）16-3725-06

Abstract： In recent years， the technologies of detecting pesticide residues have been developed rapidly. The chromatography becomes the main method for detecting pesticide residual due to its high efficiency， sensitivity and convenience. Limited by the detector， the conventional chromatographic method can not detect all residues. Detecting the residues through the chemical reaction between the residues and the derivation reagents can it greatly expand the scope of application of chromatography. Derivatization in detecting organic pesticide residues with chromatography was reviewed in this paper.

Key words： pesticide residues； derivatization； chromatography

有机农药可以分为有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯等四大类。随着农药的大量生产和广泛使用，农药残留问题日益突出，造成了严重的农药污染问题，对人体健康也构成了严重威胁[1，2]。目前测定农药残留的主要方法有色谱法、毛细管电泳法[3]、免疫分析法[4]、生物传感器法等[5]。毛细管电泳法所采用的仪器为一些普及度较低的特殊仪器，所用试剂一般价格昂贵，还不能大规模地推广使用；生物传感器法是近年来才出现的新方法，应用范围不广，仅限于有机磷等少数农药残留检测，并且该方法灵敏度和准确度都不太稳定；免疫分析法同样仅限于少数农药残留检测，一次只能检测1种化合物，而且需要大量板管等器件，成本较高。而色谱法具有高选择性、高分离效能、高灵敏度、快速等优点，因而是农药残留检测最常用、最有效的方法。但色谱法也有自身的缺点，有些农药残留物对检测仪器没有响应或响应较弱，不能直接检测，需要进行衍生化处理。衍生化技术可以扩大检测物的范围，提高样品在检测仪器上的灵敏度，改善样品混合物在色谱柱上的分离效果[6]。衍生化技术对于增加农药残留检测的种类、降低检测成本和仪器采购投入、保障饮食安全、提升中国农产品国际竞争力具有重要意义。

1 有机农药残留检测中衍生化技术简介

有机农药残留检测中的色谱法可以分为：薄层色谱法[7]、气相色谱法[8]、高效液相色谱法[9，10]、超临界流体色谱法、气相色谱-质谱法[11]和液相色谱-质谱法[12]等。其中气相色谱法、液相色谱法和色谱-质谱联用法是监测检验部门分析农药残留的主要方法[13]。薄层色谱法常用于快速定性检测，一般不涉及衍生化问题；超临界流体色谱法在实际生产中应用较少。气相色谱法适合分析有足够挥发性的物质，对极性强、挥发性低、热稳定性差的物质往往不能直接进样分析，但如果进行适当的化学处理[14]，转化成相应的挥发性衍生物就可以检测，扩大了气相色谱法的测定范围[15]；液相色谱法在分析中一般要求被测样品有紫外吸收[16]或能被激发产生荧光，对于无紫外吸收或紫外吸收较弱，不发荧光或荧光较弱的样品灵敏度很低，甚至不能检测，也需要进行衍生化处理。

1.1 农药残留检测中衍生化机理

常用于农药残留检测的衍生化试剂有：硅烷化试剂、烷基化试剂、酰基化试剂、紫外衍生试剂、荧光衍生试剂等。硅烷化试剂可以将硅烷基引入到分子中，一般是取代活性氢，降低化合物的极性，减少氢键束缚，所形成的硅烷化衍生物更容易挥发。同时由于含活性氢的反应位点数目减少，化合物的稳定性也得以加强，被检测性能增强。适用于羟基化合物，也可用于含羧基、巯基、胺基等官能团的化合物；烷基化试剂与硅烷化试剂类似，是将烷基官能团（脂肪族或芳香族）添加到活性官能团（H）上，以烷基基团代替氢的重要性在于生成的衍生物与原来化合物相比极性大为下降。该类试剂常用于改良含有酸性氢的化合物，如羧酸类和苯酚类；酰基化试剂可通过羧酸或共衍生物的作用将含有活泼氢（例如-OH、-SH、-NH）的化合物转化为酯、硫酯或酰胺，可以作为烷基化试剂的替代方法；紫外衍生试剂和荧光衍生试剂都属于改善检测性能的衍生化试剂。一般当物质在200～400 nm有紫外吸收时，考虑用紫外检测仪器，紫外衍生化试剂可以改善物质的紫外吸收效应。荧光检测仪器只对荧光物质有响应，灵敏度也高，适合于多环芳烃及各种荧光物质的痕量分析。不发荧光的物质，经荧光衍生试剂处理后可转变为荧光物质，而后进行分析。

1.2 农药残留检测中常见衍生化试剂

在农药残留检测中，可根据待测农药试样所含官能团的种类选择适宜的衍生试剂，各种常见衍生试剂的种类、代表物以及特点如表1所示。

2 衍生化技术在色谱法检测有机氯农药中的应用

有机氯农药属于神经毒物，在外界环境或有机体内均不易分解[17]，容易造成残留，致人慢性中毒，损害中枢神经系统，严重危害人体健康。由于有机氯农药的高残留特点，在食品农药残留研究中最受重视[18]。卤素具有较强的电负性，因此多数有机氯农药使用带有电子捕获检测仪器的气相色谱仪可以直接测定，部分电负性较弱或挥发性不好的有机氯农药需要进行衍生化处理，常见的是（硅）烷基化衍生试剂，例如三甲硅基重氮甲烷、五氟苯基重氮甲烷、五氟苄基溴等。有机氯农药与这些试剂反应可以增加亲电力，提高挥发性，使之适合于灵敏的电子捕获检测仪器。赵守成等[19]用气相色谱-质谱法同时检测大米中3，5-二氯苯甲酸、麦草畏、2，4-D丙酸、2，4-D、五氯苯酚等12种酸性除草剂，其中有8种是有机氯农药，样品用重氮甲烷乙醚溶液衍生化，该法回收率>80%，相对标准偏差<10%，最低检测限为0.01～0.05 mg/kg，检测限低、回收率比较理想，满足残留检测的要求。Moy等[20]用高效液相色谱法测定水中百草敌、2，4-D等多种有机氯除草剂和其他几种酸性除草剂，用三甲基硅烷化重氮甲烷作为衍生化试剂。黎源倩等[21]用带有电子捕获检测仪器的气相色谱仪分析粮食中绿麦隆残留量，提纯净化后的洗脱液经浓缩后用七氟丁酸酯直接衍生。

3 衍生化技术在色谱法检测有机磷农药中的应用

有机磷农药能够抑制体内的胆碱酶，使其失去分解乙酰胆碱的能力，从而造成体内乙酰胆碱的积累，刺激中枢神经系统[22]，使各项功能失调，引起生理紊乱，因此对有机磷农药残留的检测是十分必要的，而且有机磷农药残留是中国农药残留检测的重点[23]，气相色谱法被中国及世界上大多数国家作为有机磷农药残留检测的标准方法或仲裁方法。用气相或液相检测都可能涉及到衍生化的问题，其中气相衍生化试剂主要是利用烷基化试剂和酰基化试剂，将有机磷转化为酯类或者醚类化合物，提高有机磷的挥发性。在液相色谱检测中主要是用荧光衍生化试剂荧光胺、丹酰氯、芴代甲氧基酰氯等，在这些衍生化试剂中使用最多、衍生条件最成熟的是芴代甲氧基酰氯，衍生化反应方程式如图1所示。刘铮铮等[24]先用芴代甲氧基酰氯衍生水中的草甘膦、草铵膦和氨甲基磷酸等，再用配有荧光检测仪器的高效液相色谱仪进行检测，建立一种快速、灵敏、准确地测定水中痕量新型有机磷除草剂的分析方法，平均加标回收率分别为94.2%、90.8%、98.6%，相对标准偏差分别为4.80%、0.68%、2.80%，定性下限和定量下限分别为0.050、0.040、0.009 μg/L和0.16、0.12、0.03 g/L。Freuze等[25]在研究水中草甘膦、氨甲基磷酸与多价阳离子络合作用的影响时，也使用芴代甲氧基酰氯作为衍生化试剂，带有荧光检测仪器的高效液相色谱仪检测。曹赵云等[26]采用液相色谱-质谱法建立稻米中草甘膦及氨甲基磷酸残留量的测定方法，试样经水提取和C18固相萃取柱净化后，在硼酸缓冲液中与芴代甲氧基酰氯进行衍生反应。

另外，Zhou等[27]用带有激光感应荧光检测仪器的胶束电动色谱分析法（MEKC），全自动检测河水中的有机磷农药，试验中采用毛细管柱衍生法对有机磷样品进行在线衍生，首次采用4-氟-7-硝基苯并噁唑作为衍生化试剂，草铵膦和草甘膦的检出限分别是2.8 ng/mL和32.2 ng/mL，比传统的柱前衍生要好。邬春华等[28]采用毛细管气相色谱法，测定尿样中二烷基磷酸酯类有机磷农药代谢物的含量，样品提取物与五氟溴苄苯（PFBBr）衍生化，衍生化反应主要分两步进行，首先衍生试剂的溴原子脱离，形成带正电荷的基团，再与离子化的二烷基（硫代）磷酸酯结合生成衍生物，反应方程式如图2所示。样品的加标回收率为70.2%～93.2%，相对标准偏差小于10.0%。该方法稳定性好、灵敏度高、重现性好。

4 衍生化技术在色谱法检测拟除虫菊酯类农药中的应用

拟除虫菊酯类农药是一类广谱性杀虫剂，具有高效、低毒、生物降解性好等优点。它们是酯类化合物，具有较低的沸点，大多数是液体和低沸点固体，容易液化，因此大多数使用气相色谱法[29，30]、气相色谱-质谱法[31]等检测，待测样品一般没有衍生化的要求。

5 衍生化技术在色谱法检测氨基甲酸酯类农药中的应用

氨基甲酸酯类农药具有高效、低残留、杀虫谱广、低毒、选择性高等优点，已经替代高毒农药得到广泛应用[31]。但是这类农药一旦进入人体内，可生成具有致癌作用的亚硝基化合物，因此氨基甲酸酯类农药并不是绝对安全的。目前测定氨基甲酸酯类农药残留的方法有气相色谱-质谱法[32]、液相色谱-质谱法[33]和液相色谱法[34]等。自从1977年Moye等首次采用液相色谱柱后衍生测定氨基甲酸酯类农药残留以来，利用液相色谱柱后水解或柱后衍生法对复杂介质中氨基甲酸酯类农药的残留量进行检测越来越普遍。近年来多采用液相色谱柱后衍生技术，使氨基甲酸酯类农药中的甲氨基团在碱液作用下生成的甲胺与衍生试剂反应生成强荧光物质，再用高灵敏度的荧光检测仪器检测。该方法具有选择性高、基质干扰小的优点，是检测氨基甲酸酯类农药最有效、最灵敏的方法。使用最广泛的衍生化试剂是邻苯二甲醛和巯基乙醇，首先氨基甲酸酯类农药在碱性条件下水解产生甲胺，甲胺再与邻苯二甲醛、巯基乙醇反应生成强荧光物质，以荧光检测仪器检测，反应方程如图3所示。于彦彬等[35]用液相色谱柱后衍生荧光法测定蔬菜和水果中的13种氨基甲酸酯类农药，衍生化试剂为邻苯二甲醛和巯基乙醇，发现当巯基乙醇和邻苯二甲醛的体积比为10∶100时，荧光响应值达最大值，该方法相关系数大于0.994，保留时间的相对标准偏差为0.03%～0.22%，检测下限为2.00～2.28 mg/kg。孙磊等[36]采用柱后衍生酸酯类农药残留，样品用丙酮提取，经凝胶渗透色谱净化，通过柱后衍生系统，最后用荧光检测仪器测定，衍生化试剂为巯基乙醇和邻苯二甲醛，该方法相对标准偏差为0.4%～7.0%，检测限为0.01 mg/kg，具有灵敏度高、定性准确的优点。

另外，King等[37]将超临界二氧化碳流体作为溶剂，把全氟丁酸酐、HFBA、嘧啶等衍生化剂溶解进行衍生化反应，氨基甲酸酯类农药的衍生产物同时被提取到超临界二氧化碳流体里面，进一步促进衍生化反应，具有非常高的灵敏性，并且消除有机溶剂在衍生化反应中的使用。孟凡立等[38]建立测定黄瓜、西红柿及土壤中福美双残留的衍生化高效液相色谱法，首先福美双在碱性EDTA-Na2溶液中降解，再用碘甲烷进行甲基化处理，最后用HPLC测定该甲基化产物。在黄瓜、西红柿和土壤中福美双的添加浓度在0.05～2.00 mg/kg，平均回收率分别为74.3%～93.9%、85.7%～102.0%和83.5%～101.8%，变异系数分别为0.7%～6.3%、1.8%～4.5%和1.6%～5.3%，均在农药残留测定所允许的范围内，衍生化反应方程式如图4所示。

6 衍生化技术在色谱法检测其他农药中的应用

在实际生产中还有很多农药不属于上述四类，在检测中也会涉及到衍生化的问题。Yu等[39]同时检测水中除草剂苯噻草胺及其代谢物，将标准多组分液用甲硅烷基衍生化试剂N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺（MSTFA）衍生，该方法回收率在78.6%～101.2%，相对标准偏差为3.2%～9.2%，准确度和精确度都较高。Díez等[40]用气相色谱法检测溴草腈等酸性除草剂，为提高酸性除草剂的挥发性，用三甲基氢氧化硫（TMSH）对其进行衍生化。第一步在高温条件下将酸甲基化，第二步同样条件下酯化。许行义等[41]以五氟苄基溴（PFB-Br）为衍生化试剂，检测了水样中的多菌灵组分，在分析结果的重现性、准确度和方法的检出限方面，均获得了非常满意的结果。程永等[42]建立测定土壤中甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的柱前衍生化高效液相色谱荧光测定方法，采用三氟乙酸酐（TFAA）-甲基咪唑（NMIM）-乙腈（ACN）作为衍生化试剂。总之，当在残留检测中需要衍生化处理，可根据农药本身的化学结构及化学性质，选择合适的衍生试剂进行反应。

7 小结

随着越来越多农药残留问题的不断出现，人们对检测仪器和方法的要求也越来越高。色谱法作为现在最有效、最成熟的农药残留检测方法是其他诸多方法不可替代的。单纯的色谱法由于受到检测仪器的限制，能够检测物质的种类是有限的，而衍生化技术可以很好地弥补这一缺点，只要通过合适的衍生化反应就可以把待检物转化为适合色谱法检测的物质。显著地扩大了被检测物质的范围，可避免一些昂贵仪器的购买，特别适合配备一般的气相和液相色谱仪的实验室和检测监督机构使用。现有衍生化试剂种类不多，通用性不强，使用受到一定的限制。因此以后对衍生化技术的研究将会更加受到人们的重视，而且会向着以下的方向发展：①提高衍生化技术的灵敏度和准确度。由于衍生化的实质是化学反应，很难实现百分之百的转化率，存在一定的误差，要不断地降低误差，达到高灵敏度和准确度；②衍生化试剂具有通用性。现有的衍生化试剂通用性不强，一般只针对一种或一类待检物，因此要开发通用性强的衍生化试剂；③操作简单化。衍生化过程需要一定的设备，开发出更加先进的、专用的集成衍生化设备，可以使操作更加简单、快速，提高检测效率。

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