基于网络药理学研究枳实治疗糖尿病的作用机制

郭 华 陈月华 宋慧鹏 张 慧

辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116000

糖尿病是目前临床无法完全治愈的慢性高血糖疾病，由胰岛素分泌不足和胰岛素拮抗或两者共同引起[1]。糖尿病大多是因遗传或生活习惯不良导致的，其引起的并发症对人体器官影响范围较大，属于高发病率和高致死率的疾病之一[2]。据有关统计，如今全球糖尿病患者的数量已超过4亿，而且发病群体逐渐趋于低龄化，这将对整个社会的发展造成一定的影响[3]。目前，临床上治疗糖尿病的药物有双胍类和格列奈类等，而作用靶点单一、耐药性和副作用等一直是难以规避的问题[4]。因此，寻找安全、低毒、高效的药物是目前药学研究的主要任务。

枳实是芸香科柑橘属药材，属于理气药。现代研究表明枳实含有黄酮类、萜类和挥发油类等多种化学成分[5]。药理学研究表明其具有抗肿瘤、抗氧化、促进脂质代谢和降血糖等多种药理作用[6]。如今枳实在中医临床上用以治疗糖尿病及其并发症的方药中较为常见，但其药效成分、作用机制尚未见报道。

网络药理学是近年来新兴起的用以研究药物与疾病关联的方法，其是在大数据背景下通过综合多学科建立药物-成分-靶点-疾病网络图，系统地研究药物对疾病的干预和影响，更直观地体现中药材多成分-多靶点-多通路的作用特点，被广泛应用于中药研究领域[7]。夏珊等[8]利用网络药理学技术研究了益智仁治疗阿尔兹海默症的药效物质基础及其作用机制，发现益智仁中白杨素、原儿茶酸、圆柚酮等可能通过抗炎、促进细胞增殖分化等方面治疗阿尔兹海默症。贾成军等[9]应用网络药理学技术对岗松挥发油的药效组分、药理作用及其作用机制进行了研究。

1 材料和方法

1.1 枳实中活性成分筛选及其作用靶点收集

中药系统药理学（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）数据库收载了药材、化学成分、药代动力学参数和作用靶点等数据，为网络药理学研究提供了数据支持。通过检索枳实，获得所有的化学成分，以“口服生物利用度（oral bioavailability，OB） ≥ 20% 和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18”为标准初步筛选出可能的活性成分。收集活性成分的作用靶点，通过蛋白质数据库（UniProt）进行基因注释并剔除重复、非人源靶点，将靶点名称转化为对应的基因名称。

1.2 疾病靶点的收集及其与药物靶点取交集

分别在GeneCards和OMIM数据库中检索“diabetes”，获得疾病相关靶基因。整合两个数据库获得的基因，去除重复项，作为疾病靶基因。取药物靶基因和疾病靶基因的交集部分作为枳实治疗糖尿病的潜在作用靶点进行深入研究。

1.3 枳实-活性成分-靶点-糖尿病调控网络的构建

去除与糖尿病靶基因无关联的化学成分，将枳实活性成分及其与糖尿病交集靶点等数据上传至Cytoscape软件，构建枳实-活性成分-靶点-糖尿病调控网络图。

1.4 枳实与糖尿病交集靶点蛋白互作网络

STRING数据库综合了大量的实验数据和文献资料，被广泛用于研究蛋白之间相互作用。将枳实-糖尿病交集靶点数据上传至STRING数据库，研究物种选择“Homo sapiens”，其他条件默认，进行分析。

1.5 基因本体和京都基因与基因组百科全书富集分析

利用R语言在Bioconductor平台对枳实与糖尿病的交集靶点进行基因本体（gene ontology，GO）功能注释和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集（P≤ 0.05）分析，并将结果可视化。

2 结果

2.1 枳实中的活性成分及其对应靶点

通过TCMSP数据库检索枳实，共获得65个化学成分，限定OB和DL的值后共筛选出30个活性成分，见表1。通过蛋白数据库将化合物靶点与人类基因匹配后，共得到133个相关靶点。

表1 枳实的活性成分信息

2.2 糖尿病疾病靶点收集及其与活性成分靶点交集可视化

以“diabetes” 为 检 索 词 在 GeneCards和OMIM数据库中检索。从GeneCards数据库中检索得到13784个基因，以“相关性得分＞5”作为筛选条件，最终获得1748个基因。从OMIM数据库中检索获得2577个基因。整合检索结果，去除重复项，共获得疾病靶基因3305个。将活性成分靶基因和疾病靶基因两者取交集，交集部分则为枳实与糖尿病关联的靶基因，即枳实治疗糖尿病可能的作用靶点。枳实中活性成分与糖尿病交集靶点共有95个，见图1。

图1 枳实中活性成分与糖尿病靶点的韦恩图

2.3 “枳实-活性成分-作用靶点-糖尿病”宏观网络图

整个网络图共有119个节点，包括1个药材节点（矩形图标），1个疾病节点（V形图标），22个活性成分节点（菱形图标）和95个靶基因节点（椭圆形图标），见图2。该体系共包含356条边，每条边代表两节点之间的相互关联。其中化合物 21（芹菜素）、19（木犀草素）、17（川陈皮素）和14（柚皮素）与靶基因节点之间的连线较多，提示这4个化合物可能是枳实治疗糖尿病的主要成分。

图2 枳实-活性成分-糖尿病-靶点网络

2.4 枳实-糖尿病交集靶蛋白互作网络

95个交集靶点之间共生成1435条蛋白相互作用连线，见图3。不同的线条表示不同的互作类型，平均节点度值为30.2。筛选连线较多的前30个基因进行分析，见图4。提示INS、AKT1、IL6、MAPK3、JUN、MAPK1、VEGFA、CASP3、MAPK8和PTGS2等可能是枳实治疗糖尿病的核心靶点。

图3 枳实与糖尿病交集靶点蛋白互作网络图

图4 枳实与糖尿病交集靶点中前30个核心基因（横坐标：蛋白互作连线的数目）

2.5 GO功能注释和KEGG通路富集分析

枳实与糖尿病交集靶点的GO功能注释结果显示与104个分子功能相关（P＜0.05），就前20条进行分析。交集靶点涉及的分子功能按照P值由小到大、自上而下排列，见图5。P值越小，该功能显著性越高。交集靶点主要影响RNA聚合酶II-特异性DNA结合转录因子结合、磷酸酶结合、DNA结合转录因子结合、核受体活性、配体激活转录因子活性、蛋白磷酸酶结合、泛素蛋白连接酶结合和类泛素蛋白连接酶结合等。KEGG通路富集结果共映射出162条通路（P＜0.05），就前20条通路进行分析，见图6。横坐标表示该通路富集靶点的个数，不同通路按照P值由小到大，自上而下排列，P值越小，表示该条通路显著性越高。结果显示这些交集靶点可能通过调控PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、白细胞介素-17（interleuk-17，IL-17）信号通路、FOXO信号通路和AGE-RAGE介导的信号通路等发挥糖尿病治疗作用。值得注意的是，枳实可能对前列腺癌、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、结直肠癌和乙型肝炎等抗癌通路具有调控作用。

图5 枳实与糖尿病交集靶点的GO分子功能分析（横坐标：基因富集的数目）

图6 枳实与糖尿病交集靶点KEGG富集分析（横坐标：基因富集的数目）

3 讨论

体内外活性实验耗时较长，不可控因素较多，获取结果的过程较为缓慢，在一定程度上阻碍了药物发现的进程。网络药理学技术是近年来新兴的药物研究手段，通过融合多学科，多数据库进而形成的新型生物网络研究模式。网络药理学从整体的角度分析药物与疾病之间的关联，可以作为活性实验的导向，是寻找中药材中活性化合物的重要辅助手段。

中医临床治病用药有辨证论治，君臣佐使之说。枳实在临床上用于治疗糖尿病及并发症的方剂中较为常见，该研究基于网络药理学技术探讨了枳实治疗糖尿病的作用机制。通过限定化合物的OB和DL值并且取与糖尿病靶点具有相关性的化合物作为研究对象，结果表明枳实中含有22个成分具有潜在的治疗糖尿病作用，其可能的作用靶点有95个。其中，芹菜素通过调控PI3K/Akt信号通路发挥抗氧化应激，保护胰岛β细胞功能，减弱胰岛素抵抗，从而产生治疗糖尿病作用[10-11]。柚皮素不仅对胰岛β细胞功能具有保护作用，还可以增强胰岛素敏感性[12]。川陈皮素可以改善糖代谢，进而调节血糖平衡[13]。木犀草素可能通过抑制胰腺TLR4、JNKmRNA和蛋白表达水平，从而改善胰岛素抵抗，减轻胰腺炎症反应[14]。枳实与糖尿病交集靶点蛋白互作网络结果分析，提示 INS、AKT1、IL6、MAPK3、JUN、MAPK1、VEGFA、CASP3、MAPK8和 PTGS2可能是枳实发挥治疗糖尿病作用的关键靶点。其中，INS可参与调节胰岛素分泌，其基因突变会引起高胰岛素血症、高前胰岛素血症和新生儿糖尿病[15]。AKT1可参与调节葡萄糖和脂质代谢，进而维持血糖平衡，该基因的表达与胰岛素敏感性有关[16]。IL-6可改善糖代谢，参与炎症、胰岛素抵抗和β细胞功能障碍等反应[17]。MAPK3，MAPK1和MAPK8属于一类细胞因子，可参与炎症反应和胰岛素抵抗[18]。调控VEGFA在肾小球中表达可以保护肾小球微血管系统，减少糖尿病对肾脏造成的损伤[19]。CASP3与细胞凋亡有关，抑制该蛋白的表达可以减少心肌或肾脏等细胞损伤[20]。PTGS2可以产生前列腺素，进而负向调节葡萄糖刺激和胰岛素分泌，也可以作为炎症反应的中介，从而改善胰岛素敏感性[21]。

GO结果分析显示，枳实与糖尿病交集靶点的分子功能主要涉及RNA聚合酶Ⅱ-特异性DNA结合转录因子结合、磷酸酶结合、DNA结合转录因子结合、核受体活性、配体激活转录因子活性、蛋白磷酸酶结合、泛素蛋白连接酶结合和类泛素蛋白连接酶结合等。KEGG结果分析显示，PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、IL-17信号通路、FOXO信号通路和AGE-RAGE介导信号通路等可能是枳实治疗糖尿病的关键通路。PI3K-Akt信号通路是胰岛素发挥调节糖代谢和脂质平衡作用的重要通路[10，22-23]。HIF-1信号通路在介导肾损伤中发挥重要作用，其机制可能是通过上调HO-1水平来调控线粒体动力学[24-25]。IL-17可引起胰岛素抵抗或破环胰岛β细胞[26]。FOXO通路可加速脂肪代谢，保护胰岛细胞，同时可以改善炎症反应、细胞凋亡和氧化应激等[27]。AGE-RAGE通路可调控 NF-κB、VGEF、TGF-β1、MCP-1等基因表达，从而减少氧化应激损伤[28]。以上结果提示枳实从多成分、多靶点和多通路发挥治疗糖尿病作用。

多成分、多靶点和多通路是中药独有的作用特点，这使得它在人类预防和治疗疾病过程中发挥了重要作用。中药是发掘安全、低毒和高效天然药物的重要来源，其规避了作用靶点单一的缺点，多成分从整体上协同发挥疗效，是近年来学术界的研究热点。该研究基于网络药理学方法初步探讨了枳实治疗糖尿病的活性成分及其作用靶点与通路，结果表明枳实对糖尿病的关键靶点和通路具有调控作用，这将为后期枳实治疗糖尿病的活性成分开发及药理机制研究提供参考。目前该研究仅在大数据背景下探索了枳实治疗糖尿病可能的活性成分及其作用机理，后期仍需开展体内外活性实验对结果的可靠性加以验证。