蒙药蜀葵花DNA条形码分子鉴定技术鉴定与功效组分含量测定

陈玉花 肖田梅 白梅荣 白迎春 包桂花

1.内蒙古民族大学化学与材料学院，内蒙古通辽 028007；2.内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古通辽 028007

蜀葵花是蒙医临床常用于治疗各种水肿的蒙药材，为锦葵科蜀葵（Althaea rosea L.）Cavan.的干燥花，异名哈鲁其其格、哈鲁莫德格、炮扎木[1]。该药味咸、甘，性寒；具有利尿，消肿，清肾和膀胱热，固精，调经等功效；主要用于水肿肾热、膀胱热、遗精、月经不调等症[2]。收载于《内蒙古蒙药材标准》（1987年版），据研究资料显示，木犀草素、山奈素及槲皮素等黄酮类成分是蜀葵花发挥其利水作用的功效成分。但目前，对蜀葵花含量测定及鉴定研究报道较少见[3-4]，尤其未见采用脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）条形码技术进行鉴定的相关报道。DNA条形码分子鉴定技术是利用一个或几个标准DNA序列实现对物种的分类与鉴别[5-8]的近年来新兴的技术。该方法由于其简便、通用性高、稳定性好、不受生长环境和生长发育阶段的限制等特点被广泛用于分子系统学和物种鉴定[9-12]、生物多样性和生态学等研究，是传统鉴定方法的有效补充[13]，这为锦葵科蜀葵植物的快速鉴定提供了可能。因此，本实验采用DNA条形码分子鉴定技术对进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增并测定标记（matK） 序列的同时应用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定蜀葵花功效组分槲皮素、木犀草素和山柰素的含量，以期为蜀葵花的质量标准研究提供依据。

1 仪器与材料

JY200C型电泳仪（北京六一生物科技有限公司，批号：DYCZ-24DN）、JY-SPC型电泳槽（北京六一生物科技有限公司，批号：DYCZ-24DN）、Multigene Gradient PCR仪（北京信众和科技有限公司，批号：20162228）、QUANTUM凝胶成像系统（北京五洲东方科技发展有限公司，批号20162224）、SIGMA 3K15高速冷冻离心机（上海卢相仪离心机有限公司，批号：TGL-16M）、明澈-D超纯水机（山东新瑞分析仪器有限公司，批号：RU1804133）、高效液相色谱仪（LC-20AT输液泵，SPD-M20A检测器，CBM-20A工作站，CTO-22A柱温箱）（安捷伦科技有限公司，批号：G7129A）；离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）、Taq Master Mix（Dye）（上海西雷生物科技有限公司，批号：20190228）、matK引物（北京天根生化科技有限公司，181019-004G10）、Trans5k DNA Marker（北京天根生化科技有限公司，20190228）、琼脂糖（北京天根生化科技有限公司，批号：021-67285083）、EB（北京天根生化科技有限公司）槲皮素标准品（批号：111541-201605）、木犀草素批号（批号：111520-200201）、山柰素标准品（批号：111520-200504）、其余试剂均为分析纯；本实验所用11批蜀葵花均经内蒙古民族大学包桂花教授鉴定，见表1。

表1 蜀葵花采集分布

2 方法与结果

2.1 matK序列测定

2.1.1 引物设计 根据文献[5]选择通用引物进行matK序列扩增，3F_KIM5'-CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-3；IR_KIM：5'-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3'。委托上海生工生物工程有限公司进行合成，PCR产物扩增条带明亮、清晰。

2.1.2 总DNA提取 取11批蜀葵花新鲜组织适量，加液氮充分研磨，迅速转移到预先装有700 μl 65℃预热的缓冲液GP1的离心管中（试验前在预热的GP1中加入0.1%β-巯基乙醇），在水浴加热20 min，加入700 μl氯仿，充分混匀，12000 rpm离心5 min；将溶液转入另一个离心管中，加入700 μl缓冲液GP2，充分混匀，混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000 rpm离心30 s，弃掉废液，吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD，12000 rpm离心30 s，倒掉废液，把吸附柱CB3放入收集管中，加入600 μl漂洗液PW，12000 rpm 离心30 s，倒掉废液（本步骤重复操作），吸附柱CB3放入收集管中，12000 rpm 离心2 min，弃去废液后置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱材料中残余的漂洗液，并且吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100 μl洗脱缓冲液TE，室温放置2 min，12000 rpm离心2 min，将溶液收集到离心管中备用[6]。

2.1.3 PCR扩增及电泳检测[7-8]PCR反应体积为 50 μl，体系内含样品中总 DNA4 μl，2×Es Taq Master Mix（Dye）25 μl，ddH2O 17 μl，正反向引物各2 μl，PCR扩增反应条件为变性温度94℃ 1 min，进行35个次循环，94℃变性温度30 s，退火温度52℃、20 s，延伸温度 72℃、50 s，最后再延伸 72℃、5 min。取5 μl反应液经1.5%琼脂糖凝胶电泳，其PCR产物检测结果见图1。

图1 PCR凝胶电泳图

2.1.4 matK序列分析 matK 序列委托华大基因公司测序完成。所测得序列用CodonCode Aligner 17.0、DNDMAN和MEGA 7.0软件进行分析，结果见表2～3。

表2 蜀葵花matK序列碱基长度及G+C含量

2.2 功效组分含量测定[9-10]

2.2.1 色谱条件 Welchrom Column C18（4.6 mm×300 mm，5 μm）色谱柱，流动相为甲醇：0.1%磷酸溶液（55∶ 45），流速为 1.0 ml/min，柱温为 35℃，检测波长为365 nm，进样量10 μl。

2.2.2 对照品溶液的制备 由于蜀葵花的主要成分为槲皮素、木犀草素和山柰素，故对该药材中的上述3个成分进行HPLC含量测定，即精密称取槲皮素、木犀草素和山柰素对照品适量，分别制成0.031 mg/ml、0.036 mg/ml、0.080 mg/ml的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 对蜀葵花中的槲皮素、木犀草素和山柰素等黄酮类成分进行含量测定，故取本品粉末约0.5 g，精密称定，精密加入75%乙醇25 ml，盐酸 5 ml，称定重量，加热回流 1.5 h，放冷，用75%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。对照品与供试品色谱图分别见图2。

图2 HPLC色谱图（横坐标为保留时间；纵坐标为电压）

2.2.4 考察线性关系 精密吸取对照品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 μl注入液相色谱仪，测定峰面积。并以槲皮素（1）、木犀草素（2）、山柰素（3）的峰面积值（Y）分别对其相应的进样量（X）进行线性回归，得回归方程依次为：

Y1=5583.7X1-19730，R1=0.9998；Y2=3657X2-20722，R2=0.9998；Y3=5539.6X3-156299，R3=0.9999。结果表明，槲皮素、木犀草素、山柰素分别在0.0775～0.5425 mg、0.090～ 0.630 mg、0.1000～ 0.7000 mg范围内，与其相应的峰面积具有良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.3”项下的供试品溶液10 μl，重复进样6次，结果槲皮素、木犀草素、山柰素的RSD依次为0.69%、1.02%、0.59%，表明精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 精密称取同一批样品，按“2.2.3”项下的方法制备供试品溶液6份，分别于0、2、4、6、8、10、12 h 注入液相色谱仪，结果槲皮素、木犀草素、山柰素的RSD依次为0.55%、0.71%、0.56%，结果表明供试品溶液在12 h内测定稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 精密称取同一批样品约0.5 g，照供试品溶液制备方法制得供试品溶液6份，分别精密吸取10 μl，注入液相色谱仪，结果RSD分别为槲皮素0.69%、木犀草素1.10%、山柰素的0.55%，表明该含量测定方法具有良好的重复性。

2.2.8 回收率试验 取已知含量的样品约0.25 g，共6份，精密称定，分别加入槲皮素、木犀草素、山柰素对照品溶液 0.41、0.25、0.52 mg，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，测定并计算回收率，结果见表4。

表4 蜀葵花加样回收率试验（n=6）

2.2.9 含量测定 分别取11批样品约0.5 g，精密称定，照供试品溶液制备方法制得供试品溶液。精密吸取供试品溶液10 μl，注入液相色谱仪，测定其峰面积值，计算槲皮素、木犀草素、山柰素的含量，结果见表5。

表3 蜀葵花matK序列遗传距离（K2P）

表5 不同产地蜀葵花含量（n=6）

3 讨论

DNA条形码分子鉴定技术是对生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段[14-17]进行的检测方法。DNA条形码已经成为物种鉴定的重要工具。本实验成功扩增并测定了11份蜀葵花matK序列，测序长度772 bp，G+C含量为25.91%～34.97%，遗传距离为0.0000～0.0404，平均遗传距离为0.0105，相似度为91%～99%。结果表明，不同地区蜀葵花matK序列具有一定的变异性，此变异可能与蜀葵花所含活性蛋白表达不同有关。该方法对不同地区蜀葵花具有较大的鉴定潜力。

通过本研究发现不同地区蜀葵花中槲皮素平均含量0.2096～1.6591 mg/g，木犀草素平均含量0.1119～1.1623 mg/g，山柰素平均含量0.5333～2.8872 mg/g，提示不同地区对应组分的含量差异较大。蜀葵花功效组分含量差异可能是由蜀葵花生长的土壤、阳光、水分、气候等多种因素导致使不同地区蜀葵花新陈代谢发生变化，从而引起不同地区蜀葵花槲皮素、木犀草素及山奈素等功效组分含量变化。可见不同地区蜀葵花matK序列变异性与功效组分含量具有一定相关性，有必要进一步深入研究其功效组分合成机制与原理[18-22]。