基于对药动学及血清SCFAs的影响研究葛根芩连汤对腹泻小型猪的作用＊

刘昌顺，夏 婷，魏小涵，陈飞龙，谭晓梅

（南方医科大学中医药学院广东省中药制剂重点实验室广东省中药制剂技术工程实验室 广州 510515）

葛根芩连汤（Gegen Qinlian Decoction，GQD）为《伤寒论》经典方剂，具解表清里、升清止利之功，治疗协热下利证，临床上对感染性腹泻疗效突出。研究表明GQD具解热、抗炎、抗菌和止泻等作用[1]，其药效物质主要为黄酮类和生物碱类成分[2]。前期研究发现GQD部分功效成分在腹泻和正常小型猪体内药动学存在差异[3]，推测这可能与腹泻肠道改变对药物的处置有关，然而这种差异是否会随着治疗持续和机体康复而逐渐消失，仍不清晰。短链脂肪酸（Short-chain fatty acids，SCFAs）是肠道菌群代谢产物，能促进肠道水和电解质的吸收，维持肠道生理和稳态，调节免疫等作用[4]，是反映机体整体代谢轮廓和肠道健康状态的重要指标，已成为腹泻诊断的重要生物标志物，其含量变化可反映药物对腹泻机体的疗效进程[5]。本文通过研究GQD给药期间其主要功效成分在腹泻小型猪体内药动学的变化过程及其对血清SCFAs的影响，从机体对药物的反应及腹泻标志物水平变化的角度，动态揭示GQD对腹泻的作用。

1 仪器与试剂

1.1 实验材料

UPLC-MS/MS仪（Agilent1290 Infinity-G6410美国安捷伦公司），GC-MS仪（TRACE1300-ISQ美国赛默飞公司），HC-3018R型高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），BP211D型十万分之一天平（德国Sartorius）。

1.2 试剂

葛 根（Puerarialobata(Willd.)Ohwi；批 号171000721，产地安徽），黄芩（Scutellaria baicalensisGeorgi；批号171003251，产地河北），黄连（Coptis chinensis Franch.；批号171103221，产地四川）和炙甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.；批号161108681，产地内蒙古）购于康美药业股份有限公司，以上药材由南方医科大学中医药学院晁志教授鉴定。葛根素，大豆苷，大豆苷元，黄芩苷，黄芩素，汉黄芩苷，汉黄芩素，盐酸小檗碱，盐酸巴马汀，盐酸黄连碱，柚皮苷（GQD成分检测内标，IS），乙酸，丙酸，丁酸和2-乙基丁酸（SCFAs检测IS）对照品，均购于中国药品生物制品检定所。色谱级别甲醇和乙腈购于德国默克公司，水，甲酸，以及其他试剂均为分析纯。

1.3 实验动物

2 试验方法

2.1 GQD水煎液的制备

参考课题组前期研究制备GQD水煎液[6-7]，称取15 g葛根，在400 mL冷水中浸泡30 min后，加热保持微沸20 min，随后加入9 g黄连，9 g黄芩和6 g甘草一起煎煮10 min，2层纱布过滤后，药渣加入300 mL水再次煮沸30 min，药液2层纱布过滤后与第1次水煎液合并。将水煎液浓缩至0.3 g·mL-1生药量。水煎液适量稀释后对其主要功效成分进行含量检测，得到如下分析结果：7.05 mg·mL-1葛根素，0.90 mg·mL-1大豆苷，0.01 mg·mL-1大豆苷元，1.03 mg·mL-1黄芩苷，0.04 mg·mL-1黄芩素，0.77 mg·mL-1汉黄芩苷，0.02 mg·mL-1汉黄芩素，0.18 mg·mL-1小 檗 碱，0.04 mg·mL-1巴 马 汀 和0.10 mg·mL-1黄连碱。

2.2 动物实验

实验动物适应性喂养3天后，随机分为正常组和模型组（n=6），每组雌雄各半。按本课题前期研究进行造模[6-7]，模型组乳猪灌胃大肠杆菌液（E-coli；109CFU·kg-1），若连续腹泻超过6 h，且粪便E-coli含量大于1011CFU·g-1湿便，说明造模成功。动物实验前12 h禁食不禁水。动物均口服GQD（1.22 g·kg-1）。分别于0 h、24 h、48 h和72h给予GQD，然后分别于3 h、12 h、24 h、27 h、36 h、48 h、51 h、60 h、72 h、75 h、84 h和96 h在小型猪前腔静脉采血0.75 mL各2份，一份用肝素钠抗凝后离心（4℃，5000 rpm，10 min）得到血浆，另1份直接离心获得血清，-20℃保存待测，其中在24 h、48 h和72 h这3个时间点采血完成立即进行给药。

2.3 样品处理

2.3.1 GQD成分检测样品处理

取血浆样品100μL，精密移取IS工作溶液20μL加入血浆样品，震荡30 s，加入100μL 0.2%稀盐酸，震荡30 s，加入800μL乙酸乙酯-正丁醇（2∶1，v/v）溶液，震荡3 min，离心（4℃，15000 rpm，10 min），分取上层溶液，再以800μL乙酸乙酯-正丁醇（2∶1，v/v）溶液重复萃取一次，合并上层溶液，氮气流下吹干。残留物用200μL甲醇复溶，震荡2 min，离心（4℃，15000 rpm，10 min），取上清液进行UPLC-MS/MS检测分析。

2.3.2 SCFAs检测样品处理

取血清样品50μL，加100μL甲醇，震荡2 min，离心（4℃，15000 rpm，10 min），取上清液100μL，加入IS工作液20μL（60μg·mL-1），取上清液进行GC-MS分析。

2.4 UPLC-MS/MS分析条件

2.4.1 色谱条件

色谱柱：ACE Excel 3-C18column（2.1×100 mm，3μm）；流动相：0.1%的甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱，洗脱条件如下：0 min-2.5 min：15%-30%B，2.5 min-3.5 min：30%-35%B，3.5 min-5 min：35%-40%B，5 min-9 min：40%-60%B，9 min-11 min：15%-60%B。流速：0.4 mL·min-1；柱温：25℃；进样量：10μL。

2.4.2 质谱条件

为了能够实行印尼华人民族语言文化教育，热爱华文教育的老前辈们想方设法地兴办多种形式的华语教育机构。不过，由于华语只能作为语言课程，在学校其他主要课程中无法发挥教学用语的作用，华文教育的中华文化传承功能受到严重制约。

离子源：ESI源；毛细管电压：4000 V，雾化器压力：30 psi；干燥气流温度：350℃；干燥气流速度：8.0 L·min-1；碰撞气微高纯氮气。采集模式：多反应监测（Multiple reaction monitoring，MRM）模式。通过前期研究分别采用全扫描、选择性离子扫描和子离子扫描模式，确定各化合物的母离子和子离子，得到成分及IS的最优MRM参数[8]。

2.5 血浆GQD成分测定方法学

2.5.1 对照品溶液的制备

分别精密称取得10种GQD功效成分对照品适量，甲醇溶解，配制浓度为1.0 mg·mL-1的储备液。配制对照品混合溶液，稀释后得到系列浓度的对照品梯度溶液，用空白血浆制备标准曲线和质量控制样本。

2.5.2 方法学考察

分别进行血浆样品的专属性、线性、精密度、回收率、基质效应和稳定性试验，确认分析方法的可行性。分别以空白血浆液，含有对照品的血浆液和实验样品进行方法的专属性考察。精密移取对照品混合溶液，以分析物浓度为横坐标，各分析物和IS峰面积比值为纵坐标，通过回归运算绘制标准曲线。以高、中、低浓度的质控样品液，日内连续进样6次，日间连续进样3天，以RSD%计算精密度。质控样品进样后所得峰面积与空白血浆液处理后加相应对照品进样所得峰面积相比，计算回收率。质控样品进样后所得峰面积为分子，对应浓度的对照品溶液直接进样后所得峰面积为分母进行计算，计算基质效应。样品保存24 h后，以RSD%评价样品测定的稳定性。

2.6 GC-MS检测血清SCFAs

GC-MS检测出的血清SCFAs主要为乙酸、丙酸和丁酸色谱峰。所用毛细管柱为DB-FFAP122-3232，30 m×0.25 mm×0.25μm，载气为氮气，流速1.2 mL·min-1。初始温度80℃，保持1 min，以10℃·min-1升温至170℃，后以20℃·min-1升温至200℃，保留2 min。检测器和进样口温度分别为230℃和200℃，氢气、空气、氮气流速分别为30 mL·min-1、300 mL·min-1、30 mL·min-1。进样量为1μL，分析时间为12 min。根据SCFAs检测的专属性试验结果，绘制标准曲线分析血清SCFAs含量。

2.7 数据处理

梯形法计算GQD功效成分各时间段的药时曲线下面积（Area under curve，AUC）。SPSS20.0软件中的t-test或者ANOVA进行组间的差异分析（P<0.05具有统计学意义）。

3 试验结果

3.1 GQD治疗对腹泻小型猪的影响

给药GQD后小型猪腹泻症状有所缓解，在48 h腹泻症状基本消失，0 h-96 h，腹泻小型猪粪便含水量从91.5%±0.9%下降至66.9%±3.5%（P<0.01），与正常组小型猪粪便含水量（64.5%±5.9%）无显著差异。粪便E.coli数量从1012.5CFU·g-1湿便下降至1010.2CFU·g-1，而梭菌的数量则从103.2CFU·g-1湿便提高至106.7CFU·g-1，给药GQD前后腹泻小型猪粪便两种关键菌落的变化具有显著性差异。

3.2 GQD主要功效成分在血浆样品的含量测定

专属性试验表明空白血浆对各成分出峰时间干扰小，分析物在血浆样品出峰时间合适、峰型良好、分离度恰当（图1）。各分析物在相应范围内线性关系良好（R2>0.99），且定量下限满足样品含量检测要求（表1）。各成分在低、中、高3种浓度水平质控样品的精密度RSD小于15.0%，说明方法检测准确可靠（表2）。回收率在88.9%和107.2%之间，基质效应在82.9%和106.2%之间，提示方法准确度良好，且检测过程不受离子效应干扰。稳定性试验结果表明RSD（<15%）符合实验要求。经验证，该方法符合小型猪血浆样品中10种GQD功效成分的检测要求，可用于小型猪的药动学研究。

表1 GQD功效成分在血浆中标准曲线的绘制

表2 GQD功效成分在血浆中精密度、回收率、基质效应和稳定性试验结果

图1 GQD功效成分在血浆中专属性试验结果

3.3 GQD给药期间主要功效成分药动学研究

药动学研究表明，给药GQD后，发现其主要功效成分在正常和模型小型猪体内的药动学行为存在显著差异（图2）。在0 h-48 h，葛根素、大豆苷元、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素在腹泻小型猪体内的血药水平显著高于正常组（P<0.05），在48 h-96 h，这些成分在生理病理机体的AUC值无显著差异。0 h-96 h，葛根素、大豆苷、大豆苷元、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素在腹泻小型猪体内每天的最大血药浓度呈现递减趋势，正常组则无此现象（表3）。

图2 连续给药GQD后其功效成分在腹泻和正常小型猪体内的药时曲线（n=6）

3.4 GQD给药对小型猪血清SCFAs的影响

血清SCFAs中，乙酸含量最高，丙酸次之，丁酸最低（图3）。腹泻小型猪血清SCFAs显著低于正常组。随着给药GQD时间的延长，腹泻小型猪血清中乙酸、丙酸和丁酸的含量逐渐提高，丙酸和丁酸在72 h恢复至正常水平（P>0.05），乙酸在96 h恢复至正常。GQD对正常小型猪血清SCFAs含量无显著影响。

图3 GQD给药对腹泻和正常小型猪血清SCFAs浓度的影响

4 讨论

4.1 GQD功效成分的药动学特征

前期发现GQD给药腹泻小型猪后3-4天内可止泻，观察至7天没有反弹现象[6]，因此本文选择研究GQD连续给药4天内的药动学行为。实验过程中24 h、48 h和72 h采血与给药时间重合，为保证前一天的血药浓度不受后一天给药干扰，采用先采血后立即给药的方法进行操作。第24 h中黄芩素在模型组的血药浓度高于正常组，第48 h中黄芩苷在模型组的含量高于正常组，该结果与AUC结果相一致，即连续给药GQD后，在0 h-48 h，发现其部分功效成分在腹泻小型猪体内的血药水平高于正常组（表3），与前期单次给药结果一致[3]。血药水平升高的成分主要为黄酮类成分，由于影响药物体内处置的因素较多，造成这些成分血药水平提高的原因复杂，就本研究而言，这可能与腹泻改变GQD功效成分的肠道处置有关[9]。前期研究表明，腹泻肠道可以增加葛根素跨膜转运的渗透性，促进其肠道吸收[10]。黄芩苷可以通过大肠杆菌分泌的糖苷酶代谢为苷元黄芩素，吸收后再转化为原型吸收入血，从而提高黄芩苷和黄芩素血药浓度[11]。前期发现腹泻肠道菌群可以加速GQD糖苷类成分转化为苷元，且肠杆菌是加速其成分转化的关键菌落之一[7]，与本文结果一致。该证据同样部分解释了腹泻机体提高大豆苷元和汉黄芩素血药水平的原因。48 h-96 h，粪便含水量和E.coli数量显著下降，GQD成分在生理病理机体内的AUC值无显著差异，可能与给药后小型猪腹泻症状得到改善，肠道微生态逐渐趋于正常有关。

表3 连续给药后GQD功效成分的AUC值（h·μg·mL-1）

4.2 GQD给药对血清SCFAs的影响

针对本文细菌感染性腹泻模型，肠黏膜炎症反应及其肠黏膜屏障损伤是其主要病理过程，SCFAs作为调整肠道微生态的关键生物标志物，分子量小易于吸收入血，通过检测其血内含量可以间接观察方药对肠道局部的作用。本文结果表明，GQD给药在减轻小型猪腹泻症状的同时，提高了血清SCFAs含量，推测这与GQD调整肠道菌群结构，提高肠道SCFAs水平相关[6]。SCFAs主要由结肠梭菌类细菌所产生[12]，本研究表明GQD能提高肠道梭菌含量，降低E.coli数目，这与血清SCFAs检测结果一致[13]，推测GQD给药抑制条件致病菌E.coli繁殖，从而提高梭菌类细菌的丰度及其在肠道的定植，促进SCFAs的产生，局部改善肠道免疫调节和吸收入血发挥整体抗炎作用[13]。作为腹泻生物标志物，检测血中SCFAs水平可为临床腹泻的诊断提供参考[5]。研究已证实肠道菌群紊乱是致泻的关键病因[14]，其代谢产物SCFAs的变化水平可反映肠道菌群乃至肠道的健康状态。本文通过血中SCFAs的研究，揭示了GQD对腹泻的作用及其可能的作用机制，即通过调节肠道菌群发挥止泻作用。

4.3 GQD成分体内过程与SCFAs的联系

本研究表明0 h-48 h内，GQD中小檗碱血药水平在腹泻小型猪体内有增加趋势，但前期组织分布研究发现GQD生物碱类成分主要分布于肠道组织，吸收进入体内的含量较低[8]，提示这类成分口服后有利于缓解腹泻肠道黏膜炎症反应，推测其发挥药效的靶点场所可能在肠道，并非吸收入血。课题组前期发现GQD调节腹泻小型猪肠道菌群结构的主要功效成分可能与生物碱相关[6]，以上分析与前期报道相一致[15]：GQD功效成分小檗碱可以调节肠道菌群结构，促进产SCFAs细菌的繁殖，调节淋巴细胞Th17和Treg的平衡，减轻肠道黏膜免疫炎症。因此，生物碱类成分可能是GQD提高腹泻小型猪体内SCFAs含量的重要功效成分。此外，鉴于黄芩苷等黄酮类成分良好的抗炎作用[16]，且这类成分在肠道组织同样具有较高浓度[8]，提示其发挥药效的途径是多环节的，即除了吸收入血解热抗炎之外，还滞留于肠道组织缓解黏膜炎症反应，腹泻肠道微生态的调整可以间接促进产SCFAs细菌在肠道黏膜表面的定植。综上所述，GQD提高腹泻小型猪体内SCFAs含量可能是其功效成分群综合作用的结果，然而方药中具体哪些成分与SCFAs相关还有待进一步研究。