爱玉子上幼期爱玉子榕小蜂与虫瘿的协同发育

吴婷婷, 吴文珊, 陈友铃,*, 黄 镇, 周莲香

(1. 福建师范大学生命科学学院, 福建省发育与神经生物学重点实验室, 福州 350117;2. 台湾大学生态学与演化生物学研究所, 台北 10617)

爱玉子Ficuspumila.var.awkeotsang雌雄异株，隶属于桑科(Moraceae)榕属Ficus，分布于我国台湾、福建、浙江，分布在海拔800-1 800 m的山地(中国植物志编辑委员会, 1998)。20世纪80年代，经过野生驯化实现了爱玉子立地栽培，现已成为我国南方特有果树，其瘦果含有大量的果胶和果胶酶，可以制成风味独特、清凉消暑的冷饮(林赞标等, 1990; 赖柏全, 2010)。爱玉子榕小蜂Wiebesiasp. nr.pumilae(薜荔榕小蜂Wiebesiapumilae的相近种)属膜翅目(Hymenoptera)榕小蜂科(Agaonida)，是爱玉子的专性传粉榕小蜂(江少华, 2011; 吴文珊等, 2013a)，没有榕小蜂传粉爱玉子无法结实，没有爱玉子提供瘿花为产卵场所，榕小蜂就无法繁殖后代，榕小蜂与榕树间维持着长期稳定的互利共生关系(林赞标等, 1990; 吴文珊和陈友铃, 2008; 赖柏全, 2010)。榕小蜂幼虫在虫瘿中发育阶段漫长，与榕树互动最为亲密(Jansen-González and Sarmiento, 2008; Jansen-Gonzálezetal., 2012, 2014; Yangetal., 2012; Jiaetal., 2014; Yadav and Borges, 2018)，但由于榕小蜂个体小，生活隐蔽，对其幼期发育研究几乎空白。为了解爱玉子榕小蜂与虫瘿之间的互作机制，本研究将探讨：(1)爱玉子榕小蜂与虫瘿协同发育的动态变化；(2)爱玉子榕小蜂在虫瘿内的营养来源及位置变化；(3)爱玉子榕小蜂体长与虫瘿大小的发育相关性；(4)冬、夏季爱玉子榕小蜂发育历期的差异。开辟昆虫-植物互作研究的新视角，为进一步揭示榕树-榕小蜂协同进化的内在机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

已被产卵的爱玉子雄果采集于福建省泉州市爱玉子种植园，雌、雄株一年均有2次花期。夏季样品采集始于2018年4月10日，选定6棵爱玉子雄株，密切关注榕果发育状态，4月20日对A期未进蜂的榕果进行套袋，防止小蜂和其他昆虫进入榕果内。2018年5月10日通过放蜂获得80个同期被产过卵的进蜂榕果，此后每隔3～4 d采集3个进蜂榕果带回实验室备用，采样每周两次，直至2018年8月20日小蜂全部出飞结束。冬季样品采集时间为2018年8月1日至2019年5月30日，8月15日通过套袋放蜂获得150个同期进蜂果。

1.2 虫瘿和传粉榕小蜂发育的观察和测量

纵向切开榕果，观察虫瘿发育状况，从单个榕果中随机挑取30个虫瘿，在体视显微镜下(Nikon SMZ1500)用游标卡尺测量虫瘿的长径和短径(图1)，然后用解剖针对虫瘿进行逐层解剖。使用生物显微镜(Olympus BX51)观察虫瘿结构、爱玉子榕小蜂发育状态及其在虫瘿内的位置，运用景深扩展软件(Image-Pro Plus)和成像系统(SteREO Lumar V12)进行拍照和测量。记录虫瘿上小蜂交配孔和出飞孔的位置。榕小蜂发育历期计算：参考王芳等(2016)的统计方法，以放蜂时间为小蜂发育起点，记录小蜂的发育阶段和日龄，根据日龄表得出各阶段的发育历期。记录实验期间样地每月的平均气温和平均降水量。

图1 虫瘿形态结构示意图

1.3 虫瘿壳和瘦果果壳的形态结构比较

选取幼虫期各阶段的虫瘿和成熟的瘦果样品进行固定，固定方法参见Jia等(2014)，再经临界点干燥后取出，用铜导电胶带粘于样品台上，用离子溅射仪镀膜，放入扫描电子显微镜的样品箱进行观察。

1.4 数据分析

用SPSS17.0和EXCEL2003软件对数据进行统计学分析和作图。

2 结果

2.1 幼期爱玉子榕小蜂与虫瘿协同发育过程

爱玉子榕小蜂的产卵针插入瘿花花柱，产卵于花柱基部子房内珠被与珠心间隙中(图2: A)，瘿花花柱被产卵后枯萎(图2: B)。在产卵后的1-3 d(孵化期)，珠心组织的细胞迅速膨大，细胞液剧增，使原本紧实的珠心组织快速转化为营养薄壁组织。子房不对称膨大，导致花柱位置下移至侧方，扁圆形的子房转变为长椭球形虫瘿(图2: B)，同时，虫瘿柄也快速伸长。

爱玉子榕小蜂发育分为卵期、幼虫期和蛹期，幼虫分为5龄(虫龄划分另文发表)，无法分辨雌雄，幼虫虫体呈圆柱形，头端大，尾端小，体表光滑，躯体柔软，具13体节；1龄(图2: C)、2龄(图2: D)幼虫虫体直，3龄(图2: E)、4龄(图2: F)、5龄(图2: G)幼虫虫体弯曲呈“C”型；1-3龄幼虫虫体白色半透明(图2: C, D, E)，可看到中肠充满了白色或黄色颗粒，4、5龄幼虫的体壁肌肉组织发达，呈不透明的白色(图2: F, G)。小蜂幼虫停止取食后，排的蛹便，进入预蛹阶段(图2: H)。蛹期分为3个阶段：初期蛹(图2: I, J)、中期蛹(图2: K, L)和成熟蛹(图2: M, N)，雌雄蛹异形分化，复眼最早呈现色彩，且雄蛹发育早于雌蛹1.34±0.27 d (n=236)。

图2 幼期爱玉子榕小蜂和虫瘿的发育过程

幼虫期小蜂营养由珠心分化而来的营养层供给。在小蜂1-3龄幼虫期，营养层的细胞壁薄，细胞液含水量高(解剖虫瘿时，由于薄壁细胞被挤压或切割造成细胞液外流，故通常观察到幼虫位于透明的营养层组织液中)。4龄幼虫期虫体与白色半透明粘胶状营养层的颜色和状态十分相似(图2: F)，进入5龄幼虫期后营养层越发粘稠，呈半固态啫喱状(图2: G)。电子显微镜下，可见营养层表面存在球状分泌颗粒，其直径在小蜂1-3龄幼虫期约10～50 μm(图3: A)，在小蜂4-5龄幼虫期约5-10 μm，且分泌颗粒在泌出后再次堆叠在一起(图3: B)，推测可能是由于发育初期营养层的细胞液含水量高，易分泌，故分泌颗粒较大。由此推断，榕小蜂幼虫发育以营养层的分泌物为食。营养层在小蜂发育至5龄幼虫末期(预蛹期)时消失(图2: H)，蛹期的小蜂不再摄取食物。

图3 虫瘿和瘦果结构比较

虫瘿壳(图3: C)由表皮层、保护层和内皮层组成(图3: D)，虫瘿表皮层由子房壁外层分化而来，幼虫期白色透明，蛹期始颜色逐渐变黄，小蜂羽化时呈褐色。虫瘿内皮层由珠被分化而来，随着卵的孵化，珠心膨大，内皮层变薄并紧贴于保护层。表皮层和内皮层均胶质化，富含水分，为小蜂提供良好的湿度保障。虫瘿保护层由子房壁内层分化而来，由长管状厚壁细胞(图3: E, F)组成，细胞从虫瘿柄端向远柄端延伸，并在汇合处发生折叠(图3: G)，因此，两端保护层较厚，中部保护层较薄(图3: C)。在小蜂1-2龄幼虫期，虫瘿保护层厚壁化程度低，虫瘿壳透明(图2: C, D)，保护层各个部位的厚度较一致(图3: H)；进入3龄幼虫期，保护层细胞厚壁化明显，瘿壳透明度降低(图2: E)，3龄幼虫末期虫瘿体积已接近最大值；4龄幼虫期后虫瘿壳呈不透明的米白色。保护层是瘿壳的骨架，主要起保护作用，为小蜂提供相对独立和安全的生存空间，并对非传粉榕小蜂有一定的防御作用。

在电子显微镜下对虫瘿壳(图3: C)和瘦果果壳(图3: I)的形态结构进行比较，结果表明：(1)二者虽然均为长椭圆形，但虫瘿较为浑圆，而瘦果细长；虫瘿长(3.21±0.23 mm,n=30)和宽(1.55±0.06 mm,n=30)均显著大于瘦果的长(2.34±0.09 mm,n=30)和宽(0.89±0.11 mm，n=30)；虫瘿长宽比为2.07∶1，瘦果长宽比为2.62∶1，两者存在显著差异(P<0.05)。(2)与瘦果果壳(图3: I)比较，虫瘿壳(图3: C)保护层的厚度显著增厚，尤其在端部约增厚2倍(P<0.05)。(3)营养层功能差异，只有虫瘿营养层具备向榕小蜂幼虫输送营养液的作用。综上可见爱玉子榕小蜂的造瘿作用，既改变了壳的形态，又改变了营养输送功能。

2.2 幼期爱玉子榕小蜂在虫瘿内的位置变化

爱玉子榕小蜂1、2龄幼虫位于花柱基部(图2: C, D)，3龄幼虫迁移至虫瘿上侧(图2: E)，随着小蜂发育，愈来愈大的虫体由上侧向下扩展(图2: F, G)。1-4龄幼虫能蠕动和翻转，故虫体的头尾和背腹方向随机，但5龄前中期幼虫“C”型虫体的头尾在下(图2: G)，而末期5龄幼虫会发生“翻转”，故预蛹头尾在上，且占满整个虫瘿(图2: H)。蛹期中雌蛹的体位均“头尾在上”(100%,n=235)(图2: I, K, M)，而雄性蛹的体位多为“头尾在上”(图2: J, L, N)，少数“头尾在下”(1.67%,n=120)。

统计结果表明，97%的雌、雄爱玉子榕小蜂的出飞孔和81%的雄峰所打的交配在图中所示位置(图2: M, N，红框所示位置)，虫瘿保护层在该位置较薄，便于钻孔，也表明虫瘿内部空间狭小，小蜂活动范围有限，小蜂在化蛹时就已确定好体位，便于羽化出飞。

2.3 爱玉子榕小蜂体长与虫瘿直径的发育动态

爱玉子榕小蜂幼虫在1-4龄期生长速度较快，增长率为25.91 μm/d；5龄期生长较缓慢，增长率为6.26 μm/d；5龄末期幼虫体长增长进入平台期；蛹期小蜂体长略有增加，但增幅不大(图4)。在1-3 龄幼虫期虫瘿快速膨大(1龄幼虫期增幅尤其明显)，在小蜂发育至4龄时，虫瘿直径增长进入平台期，即虫瘿发育进入平台期的时间早于小蜂，为小蜂发育提供充足的生长空间。由于虫瘿长径增长较快(长径增长率为短径的1.80倍，长径增长率为26.43 μm/d，短径增长率为14.67 μm/d，卵期的虫瘿为扁球形，随小蜂发育至4龄初期，虫瘿变为长椭球形；虫瘿在小蜂羽化期可能由于虫瘿壳脱水，以及小蜂活动，导致长径稍缩短，而短径稍增长(图4)。

图4 爱玉子榕小蜂体长与爱玉子上虫瘿直径的发育动态

2.4 夏季和冬季爱玉子榕小蜂发育历期比较

在福建地区爱玉子榕小蜂一年2代，世代历期明显不同，夏季世代历期(5月中旬-8月中旬)约112 d，幼虫期约80 d；冬季世代历期(8月中旬-翌年5月中旬)约253 d，幼虫期约192 d。冬季各阶段幼虫的发育历期均比夏季长，尤其是5龄幼虫的发育历期，冬季(91 d)比夏季(25 d)延长了66 d，小蜂以5龄幼虫越冬，延长进食期有利越冬。从图5可知，在气温高、水分充足的夏季，爱玉子榕小蜂发育历期较短；而在气温较低、水分较少的秋冬季，爱玉子榕小蜂发育历期较长。

图5 两代爱玉子榕小蜂发育历期及水热条件比较

3 讨论

3.1 榕小蜂幼虫的摄食方式

关于榕小蜂幼虫在榕果虫瘿内的摄食方式，目前没有直接的实验研究结果，均是通过对幼虫期榕小蜂虫瘿显微解剖(Leclerc du Sablon, 1908; 姚若洁, 1998; Jiaetal., 2014)和组织切片的观察结果(Jansen-Gonzálezetal., 2012, 2014)推测榕小蜂幼虫依赖植物胚珠和胚乳组织存活，认为榕小蜂孵化后进入珠心组织中，直接摄食植物组织。但本研究根据对虫瘿结构的电镜观察可知，虫瘿营养层向爱玉子榕小蜂生存的空间分泌球状颗粒，爱玉子榕小蜂位于分泌液中；运用4%多聚甲醛对虫瘿进行固定，其结果也证明爱玉子榕小蜂幼虫与营养层(即早期为珠心组织)一直都处于分离状态。因此，我们推测：(1)榕小蜂孵化后并没有进入珠心组织中，而是依然位于珠心与珠被之间，避免伤害胚珠，让被产卵的瘿花子房仍能完成初期的发育(Verkerke, 1989)，同时也避免导致寄主植物产生抗性反应(严盈, 2008)。(2)建群蜂在产卵时将多肽、蛋白质和其他化合物混合组成的产卵分泌物注入寄主植物的组织中(Moreau and Guillot, 2005; Asgari and Rivers, 2011)，导致珠心组织的细胞迅速膨大，细胞液剧增，使原本紧实的珠心组织快速转化为柔软营养薄壁组织，为幼虫提供活动空间，虫瘿切片显示孵化后的榕小蜂位于珠心组织中(Jansen-González, 2012)，可能仅仅是幼虫与珠心组织相对位置叠加产生的现象。(3)榕小蜂幼虫并不是直接取食植物组织，而是吸食通过建群蜂产卵分泌物(Moreau and Guillot, 2005; Asgari and Rivers, 2011)和幼虫摄食分泌物(Miles, 1999; 严盈等, 2008; 郭瑞等, 2012)刺激植物组织分泌的营养液。

有人认为榕小蜂幼虫从花柱基部迁移至虫瘿上侧(远柄端胚乳所在位置)，与小蜂取食胚乳有关(Leclerc du Sablon, 1908; Verkerke, 1989; 姚若洁, 1998; Jansen-Gonzálezetal, 2008, 2012; Jiaetal., 2014)，但不以胚乳为食的重寄生肉食性非传粉榕小蜂的幼虫在3龄期也一样移动至远柄端(Galiletal., 1970; Eliasetal., 2012; Jansen-Gonzálezetal., 2014)，因此，我们推测小蜂幼虫在虫瘿内的位置变化并非由于幼虫摄食胚乳所致，而是因为榕果的胚珠为斜挂式胚珠，胚囊位于远柄端(Verkerke, 1989)，此处空隙较大，小蜂幼虫选择进入结构松散的区域，便于虫体活动。

3.2 影响榕小蜂发育历期的因素

榕小蜂寄生于榕果中，因此寄主榕果发育期是影响小蜂发育历期的首要因素。不同种类的榕树，榕果发育周期明显不同，如爱玉子榕果的发育周期长，一年结实2次，榕果的发育历期3～10月，榕小蜂的发育期与寄主榕果的发育期同步，历期亦长(吴文珊和陈友铃, 2008)；细叶榕Ficusmicrocarpa榕果的发育周期短，单株一年结实1～4次，榕果发育历期较短，其榕小蜂的发育期亦短(吴文珊等, 2013b)。在西双版纳，木瓜榕Ficusauriculata间花期约70 d，海南榕Ficushainanensis间花期约40 d，Yang等(2012)交换了木瓜榕和海南榕的传粉榕小蜂之后，发现在木瓜榕中发育的海南榕传粉榕小蜂Ceratosolensp.发育历期增长，而在海南榕榕果中发育的木瓜榕传粉榕小蜂Ceratosolenemarginatusy发育历期缩短，表明寄主榕树的繁殖特性决定小蜂发育历期。

其次，繁殖地的水热条件影响榕果发育历期，从而影响小蜂发育历期。即同一地区的同种榕树在一年中不同的季节榕果发育期不同，小蜂发育历期亦不同。例如，爱玉子榕果的发育期在水热条件较好的夏季为3～4个月，而在秋冬季为8～10个月，其传粉榕小蜂的发育历期与果同步，本实验结果表明，冬季爱玉子榕小蜂发育的各阶段历期均比夏季的长，尤其是5龄幼虫期明显延长，即延长了摄食期以应越冬(图5)。

榕小蜂发育历期还与食物源相关，寄主相同的造瘿蜂、重寄生蜂和寄居蜂，产卵时间不同(通常造瘿蜂先产卵，重寄生蜂和寄居蜂后产卵)但出飞时间相近(Cruaudetal., 2013; Yadav and Borges, 2018)，表明植食性造瘿蜂的发育历期较长，而肉食性和植食性兼具的重寄生蜂和寄居蜂发育历期较短，推测同源性食物有利于小蜂对营养成分的吸收。